米曲霉NRRL 3483中菌株特异性激活曲霉酸生物合成的机制解析

《Scientific Reports》：Strain-specific activation of aspergillic acid biosynthesis in Aspergillus oryzae NRRL 3483

本研究针对长期被视为非产毒菌的米曲霉（Aspergillus oryzae）是否保留曲霉酸（aspergillic acid）生物合成潜能的问题，通过比较黄曲霉（A. flavus）NRRL 3357与两株米曲霉（RIB40和NRRL 3483）在氨基酸富集条件下的asa基因簇表达及代谢产物输出。研究发现，米曲霉NRRL 3483在酪蛋白胨培养基中可部分激活asa簇，产生脱氧曲霉酸（deoxyaspergillic acid）和微量曲霉酸，揭示其存在下游酶催化瓶颈。该成果为解析驯化真菌次级代谢衰减机制及挖掘隐性生物合成簇提供了新视角。

　　

在真菌的世界里，次级代谢产物如同隐藏的化学宝库，不仅赋予微生物独特的生态适应性，更是人类获取抗生素、抗癌药物等重要天然产物的来源。曲霉酸（aspergillic acid）作为一种含羟肟酸的吡嗪酮类化合物，最早从黄曲霉（Aspergillus flavus）中分离得到，因其对铁离子的强螯合能力和抗菌活性而备受关注。然而，与其产毒“近亲”黄曲霉不同，广泛应用于酱油、清酒酿造的传统食用菌米曲霉（Aspergillus oryzae）长期被视为曲霉酸的非生产者，这与其在驯化过程中丧失黄曲霉毒素合成能力的特点相呼应。但近年来研究发现，某些米曲霉菌株在特定条件下可能保留潜在的次级代谢能力，挑战了“食用菌绝对安全”的简单认知。

为探究米曲霉是否真的完全丧失曲霉酸合成能力，美国威斯康星大学麦迪逊分校的Dasol Choi等人发表在《Scientific Reports》的研究，系统比较了黄曲霉NRRL 3357与两株米曲霉（RIB40和NRRL 3483）在基因组结构、基因表达及代谢产物积累层面的差异。研究聚焦于调控曲霉酸合成的asa基因簇，发现米曲霉并非铁板一块——菌株NRRL 3483在富含亮氨酸和异亮氨酸的酪蛋白胨培养基中，竟能部分激活这一“沉默”的代谢通路，产生脱氧曲霉酸和微量曲霉酸，甚至形成特征性的铁-曲霉酸红色复合物（ferriaspergillin）。这一发现不仅揭示了真菌次级代谢在驯化过程中的复杂性，也为挖掘隐性生物合成簇提供了新思路。

研究团队运用了多种关键技术方法：通过antiSMASH和clinker比对asa基因簇的基因组结构；利用qRT-PCR分析asaB、asaC、asaD、asaR等关键基因的时序表达；采用LC-MS/MS和HPLC鉴定代谢产物；并通过铁螯合实验验证曲霉酸活性。所用菌株包括黄曲霉NRRL 3357和米曲霉RIB40、NRRL 3483，培养于葡萄糖基本培养基（GMM）和酪蛋白胨（CP）培养基。

比较黄曲霉和米曲霉的曲霉酸生物合成基因簇

基因组分析显示，asa基因簇的核心基因（asaA、asaB、asaC、asaE）在黄曲霉NRRL 3357和两株米曲霉中均保守存在。但米曲霉NRRL 3483的asaA和asaB与黄曲霉的序列同源性高于米曲霉RIB40，提示菌株间存在显著差异。尤为值得注意的是，asaR（转录因子）和asaD（细胞色素P450）在米曲霉NRRL 3483中呈现单基因融合状态，而在RIB40中则分裂为三个基因，这种结构变异可能影响簇的调控功能。

黄曲霉和米曲霉中asa基因簇的表达动态

在酪蛋白胨培养基中，黄曲霉的asa基因呈现爆发式诱导：第3天时asaD表达量超11000倍，asaC、asaB和asaR同步上调，随后迅速下降。米曲霉NRRL 3483虽表达水平较低，但表现出类似的时序激活模式——asaC（负责亮氨酸和异亮氨酸缩合）最早诱导，随后asaB和asaD依次上调。而米曲霉RIB40在所有时间点均无显著表达，说明其asa簇处于完全沉默状态。这种菌株特异性激活模式提示，米曲霉的曲霉酸合成能力受到精细的转录调控。

曲霉酸及其类似物的检测

代谢组学分析证实，米曲霉NRRL 3483能合成脱氧曲霉酸（m/z 209.1649, [M+H]⁺）和微量曲霉酸（m/z 225.1596, [M+H]⁺）。值得注意的是，脱氧曲霉酸的积累量显著高于曲霉酸，且检测到羟基化衍生物（m/z 241.1546）。这一代谢谱表明，该菌株虽能启动通路初始步骤，但下游由asaD催化的羟化反应存在效率瓶颈。

铁螯合实验验证活性

通过添加柠檬酸铁铵，米曲霉NRRL 3483的培养物提取液呈现红色铁-曲霉酸复合物特征反应，证明其合成的微量曲霉酸具备生物活性。而脱氧曲霉酸因缺乏羟肟酸基团无法螯合铁离子，进一步印证了通路下游酶活性的不足。

结论与展望

本研究打破了“米曲霉不产曲霉酸”的传统认知，揭示其菌株特异性保留条件性诱导生物合成能力的现象。菌株NRRL 3483中脱氧曲霉酸的积累提示asaD酶活或表达存在瓶颈，这为解析驯化真菌次级代谢衰减机制提供了理想模型。该研究不仅深化了对真菌代谢进化的理解，更启示我们：那些被认为“安全”的工业菌株中，可能隐藏着未被发掘的天然产物宝库。未来通过调控asa簇关键转录因子asaR或优化培养条件，或可激活更多隐性基因簇，为药物开发和生物技术应用开辟新路径。