利用红酵母Rhodotorula glutinis KAEC-61从棕榈枣废弃物中高效生产食用油的统计优化与放大发酵研究

《Scientific Reports》：Statistical optimization and scaled-up bioreactor fermentation for enhanced edible oil production from palm date waste by Rhodotorula glutinis KAEC-61

本研究针对传统油脂生产面临的环境压力与资源限制问题，以红酵母Rhodotorula glutinis KAEC-61为研究对象，通过系统优化发酵工艺，成功实现棕榈枣废弃物（PDW）的高效生物转化。研究采用单变量、Plackett-Burman和Box-Behnken设计优化培养条件，在7-L生物反应器中通过补料分批发酵使脂质产量提升至14.7 g/L，脂质含量达54.4%。脂肪酸分析显示其富含油酸（C18:1）、亚油酸（C18:2）和稀有脂肪酸如γ-亚麻酸（GLA），表明其在功能性油脂和生物燃料领域的应用潜力。该研究为农业废弃物的高值化利用和微生物油脂的可持续生产提供了技术支撑。

　　

随着全球人口增长和工业化发展，对食用油、生物燃料和生物基材料的需求急剧增加。传统油料作物如棕榈、大豆和油菜的种植不仅导致 deforestation 和水资源短缺，还面临耕地竞争和季节生长限制的挑战。2022年，全球食用油和脂肪市场价值已达4644.8亿美元，且预计将继续增长。与此同时，不饱和脂肪酸在预防心血管疾病和癌症方面的健康益处日益受到关注，进一步推动了对可持续油脂来源的需求。然而，传统油脂生产系统存在生态负担大、易受气候变化影响的局限性。在这一背景下，微生物油脂（Single-Cell Oils, SCOs）作为一种潜在替代方案逐渐崭露头角。产油微生物（包括酵母、真菌、藻类和细菌）在营养限制且碳源过量的条件下，能够积累占细胞干重20%-80%的脂质，其组成与植物油脂相似，富含油酸、亚油酸和棕榈酸，可广泛应用于生物燃料、化妆品、营养品和功能性食品。

在干旱地区如中东，棕榈枣废弃物（Palm Date Waste, PDW）是一种未充分利用的木质纤维素和富糖原料。仅沙特阿拉伯每年就产生超过150万吨PDW。实验分析表明，枣果肉含有61%-79%的总糖（主要是葡萄糖和果糖），是微生物发酵的理想底物。近期研究显示，PDW水解液可被用于由鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）和胶红酵母（Rhodotorula glutinis）分别生产生物表面活性剂和微生物油脂。尽管潜力巨大，PDW在SCO生物制造平台中的应用仍十分有限。大多数研究集中于将其转化为生物乙醇或动物饲料，仅有少数以微生物油脂生产为目标。此外，多数产油酵母研究局限于摇瓶系统，未能反映工业规模发酵的动态条件。生物反应器培养能够更好地控制关键参数（如pH、氧传递和营养供给），这些对于最大化脂质积累至关重要。

为推进微生物油脂生产的商业化，必须克服菌株选育、脂质滴度优化和发酵规模放大等方面的瓶颈。尽管解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）等模式生物已被广泛研究，但非常规菌株如胶红酵母（R. glutinis）仍未被充分探索。然而，近期实验突显了R. glutinis在利用非常规碳源时的卓越脂质生产力、胁迫抗逆性和底物多样性。在良好控制的发酵条件下利用此类菌株，可能为成本效益高且可持续的微生物脂质生产开辟新途径。

本研究提出了一种基于生物反应器的策略，利用从红树林沉积物中新分离的产油酵母Rhodotorula glutinis KAEC-61将PDW水解液转化为脂质。通过Plackett-Burman设计和响应面法（RSM）优化关键发酵参数，并在7-L搅拌罐生物反应器中的批式和补料分批模式下验证了优化条件。虽然先前研究报道了使用PDW水解液生产微生物油脂，但这些研究通常局限于摇瓶试验，脂质滴度较低（<2 g/L），且缺乏过程级优化。据我们所知，这是首次将新环境分离的R. glutinis菌株与系统统计优化和基于PDW水解液的生物反应器规模补料分批培养相结合的研究。该过程实现了超过14 g/L的脂质滴度和54%以上的脂质含量，同时检测到具有营养价值的稀有脂肪酸。这些结果较早期的PDW研究有显著提升，在方法和产品层面均具有新颖性。

本研究采用了几项关键技术方法：首先从红树林沉积物中分离并鉴定了产油酵母菌株；通过单变量优化和统计实验设计（Plackett-Burman和Box-Behnken）优化了培养基组成和培养条件；利用生物反应器进行规模放大，并在pH控制下进行批式与补料分批发酵；使用棕榈枣废弃物水解液作为低成本碳源；通过FT-IR、GC-MS和NMR对产生的脂质进行了结构表征和脂肪酸谱分析。

筛选和鉴定产油酵母

从沙特阿拉伯吉达附近红海海岸线的红树林沉积物和土壤样品中分离出16株酵母菌株。通过罗丹明B和 Sudan Black B染色初步筛选，菌株Rhodotorula glutinis KH-61显示出最高的脂质滴度（>20%细胞干重），被选为进一步分析的对象。基于26S大亚基（LSU）rRNA基因部分测序，该菌株被鉴定为Rhodotorula glutinis KAEC-61，与已知序列有99%的一致性。显微分析证实了丰富的脂质体存在，支持其产油表型。

摇瓶水平培养条件的优化

通过评估时间进程、pH、温度、搅拌速度和碳氮（C/N）比对生物量积累和脂质滴度的影响，确定了最佳培养条件。脂质生产在72小时达到最大值，生物量为1.9±0.10 g/L，脂质滴度为0.56±0.06 g/L（脂质含量29%）。初始培养基pH为5.5时脂质滴度最高（0.67±0.03 g/L，脂质含量35%）。温度优化显示35°C最有利于生长和脂质生产（生物量2.23±0.37 g/L，脂质滴度0.77±0.06 g/L；脂质含量34%）。搅拌速度在50 rpm时脂质含量最高（53%），而过度搅拌（200 rpm）增加生物量但降低脂质含量至31%。C/N比对脂质生物合成有显著影响，最佳C/N比为100，此时脂质含量最高（40%），脂质滴度为3.37±0.55 g/L，生物量为8.42±0.52 g/L。

Plackett-Burman设计筛选显著营养因子

通过Plackett-Burman设计筛选了11个独立变量，包括碳源、氮源和无机盐。 Pareto图显示木糖、酵母提取物、CaCl₂·2H₂O和Na₂HPO₄是对生物量生产有显著正影响的主要因素，因此被选用于进一步的RSM优化。

响应面法优化脂质生产

采用Box-Behnken设计对上述四个因素进行优化，通过29次实验运行确定了最佳浓度和变量间相互作用。最高生物量和脂质（13.4和4.9 g/L）在第28次运行中实现。回归方程和ANOVA分析表明模型具有统计显著性（p<0.05），缺乏拟合不显著，说明模型能有效捕捉变量与生物量生产之间的关系。3D响应面图揭示了酵母提取物与CaCl₂·2H₂O以及酵母提取物与Na₂HPO₄之间的显著交互作用。

模型验证

在RSM优化器建议的条件下（53.7 g/L木糖、5.5 g/L酵母提取物、5 g/L CaCl₂·2H₂O和1.5 g/L Na₂HPO₄）进行实验，观察到生物量产量为17.44±1.0 g/L，与模型预测值13.4 g/L密切吻合，证实了模型的预测准确性。

生物反应器性能：批式和补料分批条件

将发酵从摇瓶扩大到7-L搅拌罐生物反应器，在受控条件下评估R. glutinis KAEC-61的生产能力。使用优化培养基组成和pH控制（pH 5.5）的批式发酵，以木糖为唯一碳源，96小时后生物量浓度为20.95±1.20 g/L，脂质滴度为9.35±0.35 g/L，脂质含量达44.6%。

pH控制对生物反应器发酵动态的影响

在受控（pH 5.5）和未受控pH条件下进行时序实验。在受控pH条件下，菌株表现出增强的底物利用和更快的生长动力学，72小时内完全消耗木糖（53.7±0.29 g/L），峰值生物量浓度为20.95±1.20 g/L，脂质滴度为9.35±0.35 g/L（44.6%脂质含量）。相比之下，在未受控条件下（初始pH 7，无调整），木糖消耗延迟，生物量和脂质滴度显著降低（17.44±1.0 g/L和5.92±0.26 g/L）。溶解氧（DO）谱进一步显示，pH受控培养保持了更有利的氧传递环境，DO水平稳定下降并在72小时后恢复，与活性生长结束和脂质积累开始相吻合。在未受控pH条件下，DO水平波动更剧烈，表明存在胁迫或代谢失衡。

使用木糖和PDW水解液的补料分批发酵

在pH控制的补料分批条件下，使用纯木糖发酵获得最终细胞干重（CDW）为27.0±1.08 g/L，脂质滴度为13.0±0.16 g/L，对应脂质含量48.15%，生产力为0.090 g/L/h。这表明即使在氧限制条件下，该菌株仍具有强大的发酵性能。HPLC分析显示PDW水解液含有17%总可溶性固体（172±4.2 g/L），主要由葡萄糖（64.8%）、果糖（34.6%）和少量蔗糖（0.6%）组成。提取和灭菌后未检测到羟甲基糠醛（HMF）或糠醛，确认无抑制性副产物。在这些条件下，PDW补料发酵进一步改善了性能，产生27.0±1.36 g/L生物量和14.7±0.14 g/L脂质，脂质生产力为0.102 g/L·h，脂质含量达到54.4%。这些结果突显了PDW水解液作为微生物脂质生产的低成本、营养丰富底物的优越适用性。

R. glutinis KAEC-61所产脂质的结构洞察

粗脂提取物经过酯交换反应，产生的脂肪酸甲酯（FAMEs）通过FT-IR、NMR和GC进行分析。FT-IR光谱在1744 cm^-1（C=O伸缩）、2853-2922 cm^-1（脂肪族C-H伸缩）和1000-1300 cm^-1（C-O伸缩振动）显示特征吸收带，与山梨醇三油酸酯匹配度约87%。¹H NMR在δ 5.35 ppm显示多个信号，¹³C NMR在δ 130 ppm和δ 175 ppm显示峰，分别表明不饱和碳和羰基碳原子的存在。其他信号在δ 50 ppm（甲酯基团）、20-35 ppm（亚甲基基团）和14 ppm（末端甲基基团）被观察到。GC确认了三种主要FAMEs的存在：C18:1、C18:2和C16:1，其中C18:1占主导物种（~40.3%）。该谱与其他高性能红酵母菌株报道的脂质组成相当，支持KAEC-61作为生物柴油生产的有前途候选者。

补料分批PDW发酵的脂肪酸组成

通过GC-MS分析了R. glutinis KAEC-61在补料分批培养于棕榈枣废弃物水解液上产生的脂质的脂肪酸谱。脂质提取物主要由不饱和脂肪酸（USFAs）组成，占总脂肪酸甲酯（FAMEs）的54.12%，饱和脂肪酸（SFAs）占45.88%。在USFAs中，单不饱和脂肪酸（MUFAs）是主要部分（42.05%），主要由油酸（C18:1n9c）占40.31%，其次是棕榈油酸异构体（C16:1n9和C16:1n7）的少量贡献。多不饱和脂肪酸（PUFAs）占总脂质的12.07%，其中亚油酸（C18:2n6c, 8.56%）和α-亚麻酸（C18:3n3, 1.19%）为主要组分。值得注意的是，还检测到γ-亚麻酸（0.74%）和顺式-11,14-二十碳二烯酸（0.97%），表明该菌株能够合成稀有的生物活性脂肪酸。饱和部分富含棕榈酸（C16:0）占28.47%，其次是硬脂酸（C18:0, 7.86%）和十七烷酸（C17:0, 4.33%）。微量SFAs如肉豆蔻酸（C14:0）、山嵛酸（C22:0）和花生酸（C20:0）也存在。

该谱表明，来自R. glutinis KAEC-61的脂质适用于多种应用：（i）生物柴油，由于高油酸和棕榈酸含量，提供氧化稳定性。（ii）营养品，如omega-3（α-亚麻酸）和omega-6（亚油酸、γ-亚麻酸）脂肪酸。（iii）特种化学品：由于次要生物活性MUFAs如顺式-10-十五碳烯酸和顺式-11-二十碳烯酸。该菌株从低成本、可再生底物产生高价值不饱和脂肪酸的能力，突显了其在可持续微生物脂质生物制造中的潜力。

本研究建立了一个统计优化且可扩展的发酵平台，用于利用从红树林沉积物中分离的新型产油酵母菌株Rhodotorula glutinis KAEC-61生产单细胞油。工艺开发包括培养参数、营养组成和操作策略的系统优化，并在批式和补料分批条件下的生物反应器中进行了规模放大。统计设计与补料分批生物反应器培养的整合使脂质滴度相对于未优化基线提高了26倍。新分离的KAEC-61菌株表现出强大的产油表型，得到显微检查和生化定量的支持。摇瓶水平优化显示，在氮限制条件下，C/N比为60:1，35°C、pH 5.5和中等搅拌速度下脂质积累最大化。这些培养条件促进乙酰-CoA重新定向至三酰甘油生物合成，与先前报道的产油酵母行为一致。

值得注意的是，KAEC-61的最佳脂质积累温度（35°C）显著高于大多数产油酵母通常报告的20-30°C中温范围。红海红树林环境（从中分离出KAEC-61）的特点是高盐度和季节性高温，这可能推动了这种耐热性的进化。在35°C下有效积累脂质的这种不寻常能力对工业应用是有利的，因为它减少了大规模发酵期间昂贵冷却的需求。

统计优化使用Plackett-Burman和Box-Behnken设计，确定了木糖、酵母提取物、CaCl₂·2H₂O和Na₂HPO₄作为显著影响生物量和脂质合成的关键培养基成分。尽管葡萄糖和木糖在ANOVA分析中显示出具有接近p值的统计显著性，但选择木糖作为代表戊糖进行进一步的Box-Behnken优化。该策略允许评估菌株代谢木糖的能力，木糖通常被产油酵母利用的效率低于葡萄糖。重要的是，随后使用PDW水解液的验证证实了可比或优越的脂质滴度，表明基于木糖的优化是稳健的，并可转移到复杂糖混合物中。

扩大到7-L搅拌罐生物反应器的发酵证实了R. glutinis KAEC-61在受控条件下的强大产油能力。使用木糖和pH调节（pH 5.5）的批式发酵产生9.35±1.35 g/L脂质滴度和44.6%脂质含量，突显了摇瓶水平优化成功扩大到生物反应器规模。实施脉冲补料的补料分批策略进一步改善了性能，延长了脂质积累阶段，并增加生物量至27.0±1.08 g/L和脂质滴度至13.0±0.16 g/L（48.1%含量）。这些改进与已建立的产油酵母生理学一致，其中氮限制和碳过量激活ATP-柠檬酸裂解酶和NADPH依赖途径。值得注意的是，在相同补料分批制度下，用水解的棕榈枣废弃物（PDW）替代木糖产生可比生物量但显著更高的脂质滴度（14.7±0.16 g/L）和脂质含量（54.4%）。这表明PDW水解液不仅提供可发酵糖，而且还提供可能刺激脂质生物合成的微量营养素或辅因子。在PDW上的优越性能强化了其作为工业微生物脂质生产的可持续、低成本底物的承诺。

光谱和色谱分析证实，由R. glutinis KAEC-61产生的脂质主要由产油酵母典型的脂肪酸甲酯（FAMEs）组成。FT-IR光谱揭示了与甲酯一致的关键官能团，包括在1744 cm^-1附近的强C=O伸缩和介于2853与2922 cm^-1之间的脂肪族C-H伸缩。该光谱与山梨醇三油酸酯匹配，置信度评分87%，表明以不饱和长链脂肪酸（可能包括油酸（C18:1））为主的三酰甘油样分子结构。¹H和¹³C NMR谱进一步验证了不饱和FAMEs的存在。δ 5.35 ppm（¹H）和δ 130 ppm（¹³C）的信号分别确认了烯烃质子和碳，而围绕δ 175 ppm的显著羰基区域和贯穿14-50 ppm的甲基/亚甲基峰确认了C16-C18甲酯的结构 motif。δ 70.2 ppm的次要信号可能对应于痕量甘油杂质，酯交换的常见副产物。气相色谱确认了三种主要FAMEs的存在：C18:1、C18:2和C16:1，其中C18:1占主导物种（~40.3%）。该谱与其他高性能红酵母菌株报道的脂质组成相当，支持使用KAEC-61作为生物柴油生产的有前途候选者。单不饱和和多不饱和脂肪酸的优势改善了冷流动特性，而相对较低的饱和度确保了有利的流动性和氧化平衡，特别是在可再生燃料应用中。

总之，这些发现表明，R. glutinis KAEC-61的脂质生物合成机制产生了有利的脂肪酸谱，具有潜在的工业相关性，适用于生物燃料和油脂化工应用。

KAEC-61的脂肪酸谱以油酸（40.3%）、棕榈酸（28.5%）和亚油酸（8.6%）为主。此外，检测到稀有不饱和脂肪酸，如γ-亚麻酸（GLA）、顺式-10-十五碳烯酸和顺式-11-二十碳烯酸。GLA和其他不常见PUFAs的存在表明KAEC-61拥有活跃的Δ6-去饱和酶和延长酶途径。这些可能被氮限制和PDW提供的复杂底物环境上调。此类谱在天然红酵母菌株中很少观察到，可能是对底物组成的适应性脂质重塑的结果。这些发现为系统级研究开辟了途径，以识别在该菌株中驱动PUFA生物合成的遗传和调控网络。

与已发表研究相比，R. glutinis KAEC-61在非工程酵母中展示了竞争性或优越的脂质生产力。例如，R. taiwanensis AM2352使用玉米芯水解液达到11.3 g/L脂质，而R. toruloides在葡萄糖上达到8.25 g/L。Candida parapsilosis Y19产生4.78 g/L脂质，含量39.1%。在其他系统中，Cryptococcus humicola UCDFST 10-1004在含有甘蔗糖蜜和玉米浆作为底物的培养基上生产时，产生15.5 g/L脂质，脂质含量40%。本研究报告的0.10 g/L/h生产力和54.4%脂质含量将KAEC-61置于农业废物基脂质生物加工顶级性能菌株之列。这些结果证实了该菌株在生物反应器条件下对低成本底物的稳健性和适应性。

本研究的意义通过与近期红酵母研究的比较得到进一步强调。先前研究主要集中于类胡萝卜素生产、废水增值或脂质组学，通常在摇瓶条件下进行，且缺乏过程级优化。相比之下，这项工作整合了上游菌株筛选、统计培养基优化、生物反应器规模验证和详细的脂肪酸谱分析（包括生物活性脂肪酸的检测），展示了一个工业上可行的脂质生产系统。此外，KAEC-61菌株在受控条件下保持生产力，强调了其稳健性和适用于分散或低基础设施生物加工环境。

这里开发的微生物油生产系统也具有更广泛的整合潜力。它可以嵌入木质纤维素生物精炼厂中，同时将其他枣椰残留物（如种子或压榨饼）增值为共产品，如生物炭、酶或类胡萝卜素，从而增强整体过程经济性和可持续性。这支持出现区域特异性循环生物经济模型，其中农业废物流以最少的外部投入转化为高价值生化品。

总之，R. glutinis KAEC-61作为一个代谢多功能且稳健的平台出现，用于从PDW水解液生产工业油。通过多阶段优化和扩大，脂质滴度达到14.7±0.16 g/L，脂质含量超过54.4%，使该菌株跻身于迄今为止报道的性能最佳产油酵母之列。稀有PUFAs的检测增加了独特的营养和商业维度。未来的努力将聚焦于全基因组测序和转录组分析，以识别代谢工程的目标，特别是增强去饱和酶和延长酶活性。尽管本研究在7-L搅拌罐生物反应器中展示了有希望的结果，进一步扩大到试验和工业水平将带来挑战，包括氧传递和混合限制、热移除、PDW水解液组成的变化以及泡沫/粘度管理。此外，脂质回收的下游加工必须针对成本和能效进行优化。解决这些放大因素对于完全实现KAEC-61的工业潜力至关重要。并行地，技术经济分析和生命周期评估将对于指导工业实施和支持区域生物经济发展至关重要。