健康母狗以及患有囊性子宫内膜增生、子宫积脓和卵巢囊肿的母狗生殖器官中adropin的表达情况

《The Veterinary Journal》：Expression of adropin in the reproductive organs of healthy female dogs and those with cystic endometrial hyperplasia, pyometra, and ovarian cysts

犬卵巢和子宫腺苷蛋氨酸在生理及病理条件下的表达与定位研究。通过RT-qPCR、Western blot和免疫荧光等技术，发现健康犬的Enho基因表达及adropin产量高于患子宫蓄脓（pyometra）和腺体性子宫增生（CEH）的犬。CEH组的adropin血浆浓度显著升高，而卵巢囊肿组的Enho mRNA和adropin蛋白表达均降低。免疫荧光显示adropin在健康卵巢黄体和子宫腺上皮中高表达，病理状态下定位和浓度变化与疾病严重程度相关。本研究为犬繁殖系统疾病诊断提供了新分子标志物。

　　### 1. 研究背景与意义

在犬类繁殖系统中，子宫炎症是影响母犬生育能力的重要疾病之一，其中以“子宫蓄脓”（pyometra）最为常见。该病通常发生在发情周期的黄体期，尤其是老年犬中更为普遍。子宫蓄脓的形成与多种因素有关，包括细菌感染、子宫运动性变化、免疫球蛋白浓度、激素水平波动以及遗传易感性等。与此同时，犬类的“子宫内膜增生”（cystic endometrial hyperplasia, CEH）也是与发情周期相关的一种病理状态，常与黄体期的高浓度孕酮（P4）暴露有关，导致子宫内膜结构异常，影响其恢复正常生理状态的能力。尽管这些疾病在犬类中具有重要的临床意义，但目前关于调节子宫炎症和促进子宫内膜增生的肽类因子的研究仍显不足。

在此背景下，研究人员开始关注一种名为“adropin”的肽类激素。该肽由能量稳态相关基因（ENHO）编码，具有调节葡萄糖和脂质代谢、影响免疫反应以及表现出抗炎特性等作用。已有研究表明，adropin在人类和啮齿类动物中与代谢调节和炎症反应密切相关，但在犬类中的功能和表达情况尚不清楚。因此，本研究旨在探讨adropin在健康犬和患有卵巢囊肿、CEH以及子宫蓄脓的犬的卵巢和子宫组织中的表达水平，以及其在血液中的浓度变化，从而更全面地理解其在犬类生殖系统中的潜在作用。

### 2. 研究方法

为了全面评估adropin在犬类生殖系统中的表达情况，研究采用了多种实验技术，包括实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、Western blot和免疫荧光分析。此外，还通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测了犬血浆中adropin的浓度。这些方法能够从基因表达、蛋白水平和组织定位三个层面提供全面的数据支持。

#### 2.1 伦理声明

本研究的所有样本均来自于因主人要求而接受卵巢子宫切除术（OVH）的犬只。所有样本的采集均获得了主人的知情同意，且符合欧盟第2010/63/EU号指令以及波兰《用于科学研究和教育目的的动物保护法》的相关规定。由于本研究在波兰的 Poznan 地区进行，根据该法律，不需要向当地动物实验伦理委员会申请批准。

#### 2.2 动物与样本收集

研究样本包括健康犬、患有卵巢囊肿的犬、患有CEH的犬以及患有子宫蓄脓的犬。所有样本均在犬接受卵巢子宫切除术时收集，并根据其生殖状态进行分类。具体而言，健康犬被分为三个子组：C1组（年轻犬，发情周期黄体期，BCS=4-5/9）、C2组（老年犬，BCS=4-5/9）和C3组（肥胖犬，BCS>5/9）。患有CEH和子宫蓄脓的犬则被分为CEH组（包括BCS=4-5/9和BCS>5/9的个体）和P组（包括闭锁宫颈型和开放宫颈型子宫蓄脓犬）。此外，还有一组患有卵巢囊肿的犬，根据囊肿类型（如卵泡囊肿、黄体囊肿和表层上皮结构囊肿）进一步细分。

样本收集过程中，通过临床检查、超声波成像和阴道细胞学分析来确认犬的生殖周期阶段。同时，通过检测血清中的孕酮水平，进一步验证了样本的分类准确性。所有组织样本在采集后被快速冷冻保存，以保持其生物活性，并在后续实验中进行基因表达、蛋白水平和免疫反应的分析。

#### 2.3 样本制备与组织学分析

在实验过程中，组织样本首先被固定在10%的缓冲福尔马林中，随后进行石蜡包埋和切片处理。组织切片经苏木精-伊红（H&E）染色后，用于组织学分析，以评估子宫和卵巢的结构变化。此外，部分组织样本被用于免疫荧光分析，以检测adropin的表达位置和强度。免疫荧光分析采用特定的抗adropin抗体，并结合DAPI染色来标记细胞核，通过激光共聚焦显微镜进行观察。

#### 2.4 基因表达与蛋白分析

基因表达分析采用RT-qPCR方法，通过检测ENHO基因的mRNA水平来评估adropin的表达情况。在该方法中，使用了两种内参基因（Gapdh和Actb）作为对照，以确保实验的准确性。蛋白表达分析则采用Western blot技术，通过检测adropin蛋白的表达水平来进一步验证其在组织中的存在。此外，ELISA技术被用于检测犬血浆中adropin的浓度，以评估其在血液中的分布情况。

#### 2.5 统计分析

为了确保实验数据的可靠性，研究采用了多种统计方法。对于基因表达和蛋白水平的分析，使用了一元方差分析（One-way ANOVA）和Tukey事后检验（Tukey’s post hoc test）。而对于adropin在组织中的免疫反应分析，使用了Kruskal-Wallis检验和Dunn事后检验。所有数据均以均值±标准误（SEM）的形式呈现，并通过p值来判断统计学显著性。此外，为了探讨adropin与犬的体重指数（BCS）、年龄和孕酮浓度之间的关系，还进行了皮尔逊相关性分析。

### 3. 研究结果

#### 3.1 adropin在子宫中的表达

研究结果显示，健康犬的子宫组织中，ENHO基因的表达水平显著高于患有子宫蓄脓的犬（p < 0.01）。在患有CEH的犬中，ENHO基因的表达水平也显著高于子宫蓄脓组（p < 0.05）。这表明，在健康状态下，adropin在子宫组织中的表达水平较高，而在炎症状态下，其表达水平则明显下降。此外，adropin蛋白的表达水平在CEH组和健康组中均高于子宫蓄脓组，进一步支持了其可能的抗炎作用。

#### 3.2 adropin在卵巢中的表达

在卵巢组织中，健康犬的ENHO基因表达水平显著高于患有卵巢囊肿的犬（p < 0.05）。在患有CEH和子宫蓄脓的犬中，尽管其卵巢组织可能存在病理变化，但ENHO基因的表达水平并未发生显著变化。这可能意味着，卵巢组织中的adropin表达与子宫状态之间存在一定的独立性。此外，adropin蛋白的表达水平在健康犬的卵巢组织中显著高于卵巢囊肿组，尤其是在具有正常卵巢结构但存在子宫疾病的犬中，adropin的表达水平仍然较高，表明其可能在卵巢组织中具有一定的保护作用。

#### 3.3 adropin在犬血液中的浓度

在血液中，患有CEH的犬的adropin浓度显著高于健康犬（p < 0.05），而患有子宫蓄脓的犬的adropin浓度则显著低于健康犬（p < 0.01）。此外，对于患有卵巢囊肿的犬，其adropin浓度与孕酮水平之间存在显著的正相关（r=0.4393, p < 0.01），表明两者之间可能存在一定的生理联系。然而，adropin的浓度与犬的体重指数（BCS）和年龄之间没有显著相关性，这可能意味着其在犬体内的调节机制与体重和年龄的关系较弱。

#### 3.4 adropin的组织定位与免疫反应

通过免疫荧光分析，研究发现adropin在健康犬的子宫内膜上皮细胞和腺体中表达较为明显，而在患有CEH的犬中，其表达主要集中在子宫内膜基质和囊肿壁中。在患有子宫蓄脓的犬中，adropin的表达水平显著降低，这可能与其炎症状态有关。在卵巢组织中，adropin的表达主要集中在黄体和卵泡中，而卵巢囊肿组织中，其表达水平较低，尤其是在表层上皮结构囊肿中。这些结果表明，adropin在健康组织中的表达较为活跃，而在病理状态下，其表达可能受到抑制。

### 4. 讨论

adropin在哺乳动物中已被广泛研究，其在调节能量代谢和抗炎反应中的作用得到了证实。然而，关于其在犬类生殖系统中的功能和表达情况仍存在许多未知。本研究首次系统地探讨了adropin在犬类子宫和卵巢组织中的表达情况，以及其在血液中的浓度变化。结果显示，健康犬的adropin表达水平显著高于患有子宫蓄脓和卵巢囊肿的犬，这可能与其在生理状态下对炎症的调节能力有关。

此外，研究还发现，adropin的表达与孕酮水平之间存在显著的正相关，这可能表明其在黄体期的激素调节中发挥重要作用。同时，adropin在患有CEH的犬中的表达水平较高，这可能与其促进子宫内膜细胞增殖和分化的能力有关。然而，由于adropin的表达在患有子宫蓄脓的犬中显著下降，因此其在炎症反应中的作用仍需进一步研究。

值得注意的是，尽管adropin在健康犬中表现出较高的表达水平，但在某些病理条件下，如卵巢囊肿，其表达水平显著降低。这可能与卵巢组织的结构改变有关，例如卵泡数量减少或黄体细胞数量下降。此外，adropin的表达水平还与犬的体重指数（BCS）存在一定的负相关趋势，但该相关性未达到统计学显著水平。这可能意味着，adropin的表达在肥胖犬中受到一定抑制，但具体机制仍需进一步研究。

### 5. 结论

综上所述，本研究发现adropin在犬类的子宫和卵巢组织中具有重要的生理调节作用，其表达水平在健康状态下较高，而在炎症和病理状态下则显著降低。这表明，adropin可能在维持犬类生殖系统的正常功能中起到关键作用，尤其是在黄体期的激素调节和子宫内膜增生的控制方面。然而，由于adropin的表达机制和具体作用尚未完全阐明，因此需要进一步的研究来验证其作为犬类生殖系统疾病潜在生物标志物的可行性。

此外，本研究的结果也提示，adropin的表达可能受到多种因素的影响，包括激素水平、炎症状态和体重指数。未来的研究可以进一步探讨这些因素如何影响adropin的表达和功能，从而为犬类生殖疾病的诊断和治疗提供新的思路。尽管本研究存在样本量较小、年龄和品种多样性不足等局限性，但其结果仍为犬类生殖系统的研究提供了重要的参考。