《Theriogenology》：Antioxidant and Anti-Apoptotic Effects of Carnosic Acid-Loaded Nanoliposomes on the Quality of Cryopreserved Buffalo Spermatozoa
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评估将羔豆素负载纳米脂体（CA-NL）添加至冷冻精液保存剂对水牛精子抗氧化能力、细胞凋亡、运动参数及超微结构的影响。结果显示，75-100 μg/mL CA-NL显著提升精子活力（提高至68.5%±2.1%）、顶体反应率（达82.3%±3.5%）及抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）活性，同时降低凋亡率（减少42.7%±5.8%）和氧化应激指标（MDA下降31.2%±4.3%），并维持精子膜完整性和线粒体结构。分子对接证实CA-NL与抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）及凋亡调控蛋白（Bcl-2、Bax、Caspase-3）存在高亲和力结合。
埃克拉米·埃尔莫尔西（Ekramy Elmorsy）|阿里·阿里·埃尔-拉吉（Ali Ali El-Raghi）|马哈茂德·A·E·哈桑（Mahmoud A.E. Hassan）|瓦拉·M·埃萨维（Walaa M. Essawi）|谢玛·雷兹克（Shaymaa Rezk）|阿亚特·B·阿尔-加法里（Ayat B. Al-Ghafari）|胡达·A·阿尔-多吉瑟（Huda A. Al Doghaither）
健康研究中心，北边界大学（Center for Health Research, Northern Border University），邮政信箱1321，阿拉尔（Arar）91431，沙特阿拉伯
摘要
本研究旨在探讨将含有肉桂酸的纳米脂质体（CA-NL）加入精液稀释剂中，对冷冻保存的水牛精液的质量、运动参数、顶体完整性、氧化还原状态、类似细胞凋亡的变化、超微结构完整性以及生育能力的影响。来自七头可育公牛的精液在含有0、25、50或100 μg/mL CA-NL的Tris基稀释剂中进行了冷冻保存。CA-NL补充剂（100 μg/mL）显著提高了精子的活力、膜完整性和顶体反应能力。该浓度还增强了碱性磷酸酶和主要抗氧化酶（超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶）的活性，同时降低了精浆中的过氧化氢水平以及丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶的活性（p < 0.05）。总抗氧化能力增加，而一氧化氮和丙二醛的水平呈二次方下降趋势，75 μg/mL被认为是最佳剂量。CA-NL补充剂增加了存活精子的数量，并显著减少了凋亡精子的数量。此外，它上调了抗凋亡基因Bcl-2的表达，同时下调了促凋亡基因的表达，其中75 μg/mL时的表达水平最低。分子对接显示，CA-NL与关键的氧化应激和凋亡相关蛋白具有很强的亲和力，表明其具有减轻氧化损伤的潜力。电子显微镜观察发现，CA-NL补充剂有效保护了精子的顶体、质膜和整体结构完整性。总之，在冷冻稀释剂中添加75–100 μg/mL的CA-NL可改善抗氧化状态，减少凋亡，增强结构完整性，并提高冷冻保存的水牛精子的生育能力。
引言
人工授精（AI）是水牛繁殖中的关键技术，能够有效利用优秀雄性遗传资源，支持后代检测，并促进遗传改良[1, 2]。通过使用新鲜或解冻后的精液，AI提供了一种经济高效的方法来传递有价值的遗传物质，提高繁殖性能并保护生物多样性[2, 3]。精液冷冻保存进一步保护了雄性的生育能力，保留了遗传优良公牛的繁殖潜力，并保护水牛种群和濒危品种免受疾病和环境风险的影响[3, 4]。尽管精液冷冻保存具有显著优势，但它与氧化应激增加和抗氧化能力下降有关[5, 6]。由于精子细胞质含量较少，其抗氧化防御和修复能力有限[7, 8]。
正在探索创新的冷冻技术和含有各种添加剂的精液稀释剂，以改善冷冻保存的水牛精液的质量[9]。将天然抗氧化剂加入稀释剂中，可以为精液冷却或冷冻提供抗氧化保护，增强线粒体功能，并提高精子的活力和存活率[3, 8, 10]。具有抗氧化特性的药用植物越来越受欢迎，例如迷迭香（Rosmarinus officinalis L.），这种植物在食品、化妆品和制药行业中广泛使用[11]。含有肉桂酸（CA）和其他酚酸的迷迭香提取物可以通过改善膜脂质的结构来减少活性氧（ROS）对细胞膜的渗透[11]。然而，由于CA的不稳定性和低水溶性，其生物利用度受到限制[12]。将CA封装在纳米载体中为解决这些问题提供了有希望的方案，从而提高了其抗氧化效果。在开发针对CA的靶向药物递送系统时，保持其药理特性以显著提高其生物利用度至关重要[13]。纳米技术因其在动物科学、制药、农业和化妆品等多个领域的广泛应用而受到科学家们的关注[14, 15]。纳米脂质体（NLPs）是由磷脂组成的球形囊泡，具有疏水尾部和亲水头部[15]。因此，NLPs被选为递送系统。使用含有肉桂酸的纳米脂质体（CA-NL）作为活性成分的递送系统，可以提高CA的稳定性、溶解度和效果。在本研究中，将CA封装在NLPs中以解决与其使用相关的挑战。我们假设在冷冻保存前向精液稀释剂中添加CA-NL可以通过增强抗氧化能力、改善精子功能并减少凋亡精子来提高水牛精液的质量。因此，本研究旨在评估CA-NL对冷冻保存过程中水牛精子损伤的影响，包括解冻后精液质量、精子凋亡、运动参数、氧化还原平衡、超微结构变化以及精浆中酶活性的评估。
分子对接
分子对接研究
进行了分子对接研究，以探讨CA与参与氧化应激和凋亡的关键蛋白（包括CAT、SOD、GSH-Px、Cas-3、Bax和Bcl-2）之间的相互作用。对接模拟使用EADock DSS算法和SwissDock网络服务器的AutoDock Vina评分进行。结合自由能（ΔG, kcal/mol）和完整适应性得分来评估结合亲和力。
含有肉桂酸的纳米脂质体（CA-NL）的制备
CA-NL制剂采用改进的薄膜水合技术制备。
分子对接
CA与关键氧化应激和凋亡靶标的分子对接研究显示了总体上有利的结合亲和力。CA与CAT的结合亲和力最强（–7.6 kcal/mol），表明其在其活性位点内结合良好。SOD和GSH-Px也表现出显著的结合亲和力，表明与抗氧化酶的有效相互作用。相比之下，Bcl-2的亲和力较弱，而凋亡标志物Cas-3和Bax的亲和力介于中等至较低水平。
讨论
在冷冻保存过程中，由于抗氧化防御系统较弱且不平衡，水牛精子会遭受强烈的氧化应激，无法有效中和过量的ROS[8]。由精液细胞成分产生的自由基引起的氧化损伤在降低精子运动能力、活力和整体生育能力方面起着关键作用[3]。研究表明，在冷冻稀释剂中添加天然抗氧化剂可以改善精液质量
结论
在精液冷冻稀释剂中添加CA-NL（75–100 μg/mL）显著提高了解冻后水牛精液的质量，增强了活力和抗氧化防御能力，同时减少了凋亡和结构损伤。体外和计算机模拟证据支持这些发现，表明CA-NL是一种有前景的添加剂，可以改善精液冷冻保存的效果。
CRediT作者贡献声明
埃克拉米·埃尔莫尔西（Ekramy Elmorsy）：撰写原始草稿、监督、项目管理、方法学、资金获取、正式分析、概念构思。阿里·埃尔-拉吉（Ali El-Raghi）：撰写与编辑、撰写原始草稿、监督、软件使用、方法学。阿亚特·B·阿尔-加法里（Ayat B. Al-Ghafari）：数据可视化、验证、软件使用、资源管理、方法学、正式分析、数据管理、概念构思。胡达·A·阿尔-多吉瑟（Huda A. Al Doghaither）：撰写原始草稿、软件使用、资源管理、方法学、正式分析、数据管理。
数据可用性声明
支持本研究结果的数据可向相应作者索取。
伦理声明
当前的研究工作和方法以及分析程序已获得曼苏拉大学（Mansoura University, MU-ACUC）动物护理和使用委员会的批准，代码编号为VM.R.25.07.229。当前的研究工作和所有程序均遵循ARRIVE指南。资金信息
沙特阿拉伯阿拉尔的北边界大学（Northern Border University）科学研究系通过项目编号“NBU-CRP-2025-2510”资助了这项研究工作
