通过高分辨率近红外光谱检测细胞外生物液体中的肺癌细胞

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Detection of lung cancer cells via high-resolution near-infrared spectra of extracellular biofluids

基于近红外光谱结合小波包变换和偏最小二乘判别分析，研究成功区分肺癌细胞（A549、H1975）与正常肺上皮细胞（BEAS-2B）的体外培养液，分类准确率达100%。光谱分析显示水分子氢键网络结构变化与肿瘤代谢异常相关，为非侵入性癌症检测提供了新方法。

　　

李涵|郎伟伟|孙梦婷|罗毅|赵佳萌|邵学光|董琳毅

天津医科大学药学院，中国天津300070

摘要

癌细胞的异常代谢会导致细胞外液化学成分的变化，这些变化可能成为癌症检测的潜在指标。本研究开发了一种方法，利用近红外（NIR）光谱结合化学计量学来分析细胞外生物流体中的癌症相关特征。通过小波包变换（WPT）获得高分辨率的NIR光谱，并用于分析从肺癌细胞（A549、H1975）和正常支气管上皮细胞（BEAS-2B）培养上清液中提取的样本。结合蒙特卡洛无信息变量消除（MC-UVE）的部分最小二乘判别分析（PLS-DA），成功区分了癌细胞和正常细胞样本，分类准确率为100%。选定的特征波长与生物成分（56.8%）和水分子（43.2%）的吸收相关。此外，根据细胞培养过程中的光谱变化，正常样本显示出稳定的代谢行为以及弱氢键水结构的逐渐增加。相比之下，癌细胞细胞外液中的异常光谱变化可能归因于乳酸和丙酮酸的过度释放，导致酸性微环境的形成，破坏了水的氢键网络。这些发现表明，通过小波包变换增强的高分辨率NIR光谱为癌症检测提供了一种敏感的策略。此外，具有不同氢键的水结构可能作为检测生物流体中癌症相关变化的潜在探针。

引言

肺癌的诊断传统上依赖于放射成像和组织活检。然而，传统方法存在固有的局限性，包括灵敏度有限、辐射暴露和侵入性。随着医学技术的进步，生物流体的分析已成为癌症检测的一种有前景的策略[1]，它在早期诊断和疾病监测方面具有潜力，并且具有高灵敏度和低侵入性等优点[2]。癌细胞和正常细胞之间的代谢差异会导致细胞外液化学成分的变化，这些变化可以作为肿瘤特异性特征的分子指标。生物流体中的常规生物标志物，如循环肿瘤DNA、外泌体微RNA和癌胚抗原，通常使用聚合酶链反应（PCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）等技术进行检测[3][4][5]。然而，繁琐的样本预处理和这些特定生物标志物的低丰度可能会限制分析性能[1]。

振动光谱通过化学成分的光谱吸收提供了对样本中生物分子的全面表征。作为一种快速且非破坏性的技术，近红外（NIR）光谱在生物液体分析中受到了越来越多的关注[6]。生物系统中的异常或疾病会导致生物流体的化学成分变化，从而改变相应的光谱模式[7,8]。然而，由于NIR光谱的吸收带较宽且重叠，与结构或组成差异相关的微妙光谱变化常常被水的强吸收所掩盖。因此，化学计量学方法对于提取与疾病相关的有效信息至关重要[9,10]。离散小波变换（DWT）被用于提高NIR光谱的分辨率并去除背景，通过部分最小二乘判别分析（PLS-DA）成功区分了疑似肾病患者和健康对照者的血清样本[11]。此外，由于水的氢键结构对体液组成的变化非常敏感，NIR光谱中的水谱可以反映生物系统的疾病状态，而无需使用外源性探针[12]。利用连续小波变换（CWT），可以识别具有不同氢键的水结构的光谱特征。基于健康对照者、糖尿病患者和冠心病患者血清样本中强氢键和弱氢键水结构的温度诱导光谱变化，实现了疾病分类[13]。此外，结合变量选择方法，利用与水相关的吸收带来确定细胞外液和细胞内液的pH值，模型性能良好[14]。通过多元线性回归（MLR）和PLS模型准确量化了培养基中的癌细胞数量，并发现酚红的存在通过改变水结构提高了预测准确性[15]。

小波变换（WT）是一种从重叠的NIR光谱带中提取高分辨率信号的强大方法[16,17]。CWT被认为是一种具有良好平滑效果的导数计算方法，其中信号通过由尺度参数确定的小波滤波器进行处理[18]。相比之下，DWT将信号分解为细节成分和近似成分，分别代表高频和低频信息[19,20]。近似成分进一步通过更大尺度的小波滤波器进行分解。最近，小波包变换（WPT）被开发出来，可以进一步分解细节成分和近似成分，从而获得比DWT更高分辨率的光谱成分[21]。利用WPT获得了富含水的混合物的高分辨率NIR光谱，并识别了具有不同氢键的OH结构[21]。此外，通过WPT获得的增强分辨率的NIR光谱揭示了聚脯氨酸和冰之间稳定界面水的特征峰[22]，以及聚（乙烯醇）的OH基团与类冰结构的相互作用[23]，为抗冻过程中保护剂与水/冰之间的相互作用提供了见解。

在本研究中，借助WPT分析了两种肺癌细胞（A549、H1975）和正常肺上皮细胞（BEAS-2B）在不同细胞密度和培养时间下的细胞外液高分辨率NIR光谱，以区分癌细胞和正常细胞样本。通过主成分分析（PCA）和PLS-DA区分了这三种类型的流体。研究了细胞培养过程中与生物分子和水相关的吸收区域的光谱变化，以阐明癌细胞和正常生物流体之间的代谢诱导光谱差异。

样本制备

样本制备

BEAS-2B、A549和H1975细胞来自天津医科大学癌症研究所及医院。细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中培养，并在37°C和5% CO₂的湿润培养箱中保存[24,25]。当细胞覆盖培养皿约90%时，进行传代培养以维持存活率。分别在细胞培养1至12天后收集培养上清液。

光谱分析和分辨率增强

图1(a)显示了RPMI 1640培养基以及A549、H1975和BEAS-2B细胞（细胞密度为2250个细胞·mL^?1）培养上清液的NIR光谱。在大约6900 cm^?1和5200 cm^?1处观察到两个主要吸收带，分别对应于OH伸缩的第一泛音和OH弯曲与伸缩振动的组合[9,36]。由于5200 cm^?1处的吸收带强度超出了光谱仪的检测范围，因此该光谱

结论

在本研究中，分析了不同细胞密度和培养时间下肺癌细胞（A549、H1975）和正常细胞（BEAS-2B）培养上清液的NIR光谱。通过WPT获得的增强分辨率的光谱有效地放大了三种细胞类型之间的关键光谱差异。使用PCA和PLS-DA结合MC-UVE进行了判别分析，成功将癌细胞样本与正常细胞样本区分开来，分类准确率为100%。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：21605114）和天津市教育委员会高等教育科技发展基金（项目编号：2022ZD053）的财政支持