基于级联放大的模块化三元DNA逻辑电路，用于精确识别循环肿瘤细胞

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Cascaded Amplification-Based Modular Ternary DNA Logic Circuit for Precise Identification of Circulating Tumor Cells

本研究开发了一种基于三元AND逻辑门的多aptamer肿瘤细胞检测系统，通过结合TMSD信号扩增和EDR双输出链设计，显著提升低丰度CTCs的检测灵敏度与特异性，为精准癌症诊疗提供新工具。

　　肿瘤细胞的精确识别对于疾病的诊断和治疗至关重要。在这一过程中，肿瘤标志物发挥着关键作用。然而，仅依赖单一的肿瘤标志物检测方法往往难以区分不同类型的肿瘤细胞，导致可能出现假阳性信号。为了解决这一问题，我们开发了一种基于多适配体的三元DNA逻辑门系统。该逻辑电路能够通过靶向不同的细胞表面蛋白进行识别操作，充分运用DNA纳米结构的功能和框架特性。通过Toehold介导的链置换（TMSD）级联放大反应，将链信号转化为电信号。这种集成多模块的三元DNA逻辑门系统能够在六种细胞系中实现准确的识别，同时实现对目标肿瘤细胞的高灵敏度检测。将DNA逻辑计算与适配体结合的生物传感器不仅有助于实现肿瘤细胞的准确识别，还在药物输送和癌症治疗领域展现出巨大的应用潜力。

癌症是目前全球死亡的主要原因之一，对公共卫生构成了重大挑战。准确识别癌细胞对于早期诊断和治疗具有决定性意义。传统活检方法虽然能够获取组织样本，但因其侵入性，不适合用于常规的癌症筛查。而且，这些方法往往难以提供关于原发肿瘤的关键生物学信息。相比之下，循环肿瘤细胞（CTCs）是从原发肿瘤脱落并进入血液循环的细胞，提供了一种非侵入性的替代方案，能够为癌症的发展提供有价值的信息。CTCs在血液中的识别可以分为两大类：物理方法和生物方法。基于物理特性的方法，如电荷、尺寸和密度，虽然成本较低，但存在效率低下和特异性不足的问题。相比之下，基于生物特性的方法，特别是利用肿瘤特异性标志物的过表达，因其高亲和力和特异性而被广泛应用于CTCs的检测。肿瘤细胞通常比正常细胞表现出更高的膜蛋白水平，因此许多研究聚焦于基于高表达膜蛋白的CTCs识别方法。

基于单一标志物的生物传感器虽然能够有效区分肿瘤细胞和正常细胞，但在临床实践中面对复杂样本时仍存在困难。一方面，由于多个细胞亚群可能共享相同的生物标志物，依赖单一标志物可能导致假阳性信号。另一方面，多色免疫荧光染色虽然能够区分不同细胞，但这一过程繁琐且昂贵。因此，对多种标志物的综合分析对于提高细胞识别的准确性和特异性至关重要。得益于其可编程性和固有的生物相容性，基于DNA的分子计算已成为生物医学应用中的有力工具。特别是，DNA逻辑门系统的并行处理能力使得对多种样本的高效分析成为可能，为复杂生物数据的处理提供了显著优势。Kong等人开发了一种DNA分子计算平台，能够同时检测和逻辑分析多种miRNA。Lai等人则开发了一种利用L-DNA和多适配体的细胞表面逻辑设备，在FBS缓冲液中实现了更高的特异性。此外，由于CTCs在外周血液中含量较低，这需要传感器能够对低浓度样本做出高效响应，从而大大有助于肿瘤的早期临床筛查。同时，DNA逻辑电路在响应过程中可能会导致DNA链的损失，进一步降低传感器的信号强度。因此，有必要在DNA逻辑电路中引入信号增强机制，以弥补逻辑操作中的信号损失，并将链信号转化为电信号。

在这一背景下，我们设计了一种三元AND逻辑门电路，该电路采用多级适配体策略，能够准确检测CTCs，并通过DNA分子电路生成电信号作为输出。AND逻辑门的工作原理如图1A所示，涉及设计多个能够靶向不同细胞表面标志物的DNA适配体。只有当目标蛋白同时表达时，才会输出一个真正的信号。通过模块化设计，将TMSD与EDR、DNA行走者和DNA折纸纳米花相结合，实现了对信号的级联放大，从而补偿逻辑操作中的信号损失，并将链信号转化为电信号。在这一过程中，DNA行走者的酶和底物被共同设计并整合到TDN中，使得触发、切割和捕获过程在TDN上高效进行，显著增强了逻辑电路的集成度。与依赖单一或双膜蛋白的逻辑门系统相比，设计的逻辑门系统具有更严格的阈值，从而有效减少假阳性信号。此外，该逻辑电路中采用的多阶段信号放大设计显著提高了灵敏度，使得对低丰度CTCs的检测更加有效。

在实验设计方面，我们采用了一系列化学试剂和材料。Tris(2-羧乙基)膦酸盐（TCEP）、钾高铁氰化物（K3Fe(CN)6）和氯化锌（ZnCl2）均购自Sigma-Aldrich公司，而6-巯基-1-己醇（MCH）则来自Aladdin公司。Microcloth和氧化铝粉末由Aida Hengsheng Technology Development Co., Ltd.（天津，中国）提供。所有电极和电化学工作站（型号660E）均购自CH Instruments, Inc.（上海，中国）。实验中所用的相关DNA适配体、DNA酶及其他序列均经过精心设计和选择，以确保逻辑门系统的稳定性和灵敏度。

在逻辑门的设计中，我们采用了三元AND逻辑门结构，如图1B所示。选择上皮细胞粘附分子（EpCAM）、蛋白酪氨酸激酶-7（PTK7）和转铁蛋白受体（CD71）作为目标蛋白，并设计了相应的适配体结构。为了减少适配体之间的相互干扰，我们在T-strand上引入了间隔碱基。细胞识别过程如图1C所示，通过适配体与目标蛋白的特异性结合，实现对CTCs的识别。同时，通过TMSD级联放大反应，将链信号转化为电信号，从而提高检测的灵敏度和准确性。这一过程涉及多个模块的协同作用，包括EDR、DNA行走者和DNA折纸纳米花，以确保信号在逻辑操作中的稳定传递。

此外，DNA自我组装技术已被广泛应用于DNA结构从一维到二维甚至三维的构建，使得复杂的功能性结构得以创造性地设计。在逻辑电路中的应用，进一步提升了电路的集成度。同时，四面体DNA框架（TDN）因其独特的结构刚性和可编程性，成为逻辑门系统的优秀载体。在固相表面修饰的情况下，TDN表现出优异的固液界面特性，使其成为电化学生物传感的理想材料。这些技术的结合不仅提高了检测的准确性，还为肿瘤细胞的识别提供了更加可靠的手段。

在本研究中，我们采用的三元AND逻辑门系统具有显著的优势。首先，通过多级适配体策略，能够同时检测和识别多种细胞表面蛋白，从而提高识别的准确性和特异性。其次，通过TMSD级联放大反应，实现了信号的增强，有效减少了信号在逻辑操作中的损失。最后，将DNA行走者的酶和底物整合到TDN中，使得触发、切割和捕获过程在TDN上高效进行，从而提高逻辑电路的集成度和稳定性。这些技术的结合，使得我们的逻辑门系统能够在复杂的生物样本中实现对CTCs的高灵敏度和高选择性检测。

通过上述方法，我们成功构建了一种能够准确识别CTCs的三元AND逻辑门系统。该系统不仅能够实现对多种细胞表面蛋白的检测，还能够将链信号转化为电信号，从而提高检测的灵敏度和准确性。同时，该系统具有良好的稳定性，能够在复杂的生物样本中保持较高的识别效率。在实际应用中，这种系统有望用于肿瘤的早期筛查，为癌症的诊断和治疗提供新的思路和方法。此外，该系统在药物输送和癌症治疗领域的应用也具有广阔前景，能够为精准医疗提供技术支持。

在实验过程中，我们还对相关材料和试剂进行了详细的分析。例如，TCEP用于还原DNA链，K3Fe(CN)6和ZnCl2用于电化学检测，MCH用于表面修饰，Microcloth和氧化铝粉末用于电极的构建。这些材料的选择和使用，确保了实验的顺利进行和结果的准确性。同时，我们还对实验设备进行了详细的说明，包括电极和电化学工作站的型号及供应商，以确保实验的可重复性和可验证性。

在实际应用中，我们采用的三元AND逻辑门系统具有重要的意义。首先，它能够提高对CTCs的识别准确性和特异性，从而减少假阳性信号，提高诊断的可靠性。其次，通过信号增强机制，如TMSD级联放大反应，能够有效补偿信号在逻辑操作中的损失，提高检测的灵敏度。最后，该系统在药物输送和癌症治疗领域的应用，能够为精准医疗提供新的技术支持。这些优势使得我们的研究在生物医学领域具有重要的价值和应用前景。

综上所述，我们开发的三元AND逻辑门系统为CTCs的识别提供了一种新的方法。该系统通过多级适配体策略，能够同时检测和识别多种细胞表面蛋白，从而提高识别的准确性和特异性。通过TMSD级联放大反应，将链信号转化为电信号，提高检测的灵敏度。同时，将DNA行走者的酶和底物整合到TDN中，使得触发、切割和捕获过程在TDN上高效进行，提高逻辑电路的集成度和稳定性。这些技术的结合，使得我们的研究在生物医学领域具有重要的价值和应用前景。