《Process Biochemistry》：Self-assembling multi-enzyme complex for production of spermidine from putrescine
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精胺是一种天然多胺化合物，具有抗衰老和抗癌潜力。本研究通过构建自组装多酶复合体，将 SpeE 和 SpeD 通过 CohesinⅡ-DockerinⅡ相互作用结合，使精胺合成反应时间从8小时缩短至3小时。同时，采用 cyanobacterial carboxysome 蛋白 CcmK2 作为天然支架，显著提升复合体在高温高压条件下的稳定性。实验优化了金属离子、温度和pH参数，验证了蛋白工程和合成生物学在高效生物催化中的潜力。
Jiaxiang Yuan|Yi Liu|Xinfeng Hu|Jiao Feng|Kequan Chen|Xin Wang|Sheng Xu
中国江苏省南京市南京工业大学生物技术与制药工程学院材料导向化学工程国家重点实验室，邮编211816
摘要
精胺是一种天然存在的多胺化合物，由于其延长寿命的特性和在癌症治疗中的潜在应用，在生物医学研究中受到了广泛关注。传统的生物合成方法虽然环保，但反应时间较长。本研究创新性地构建了一个自组装的多酶复合体，以提高从腐胺生成精胺的效率。通过CohesinⅡ和DockerinⅡ之间的特异性相互作用，形成了由精胺合成酶（SpeE）和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SpeD）组成的双酶复合体来催化精胺的合成。与自由酶系统相比，反应时间从8小时显著缩短至仅3小时。通过研究金属离子添加剂、反应温度和pH值，确定了最佳的精胺生产条件。此外，还开发了一种以蓝细菌羧体蛋白（CcmK2）为天然支架的复杂多酶复合体。这种CcmK2-SpeE-SpeD复合体在恶劣条件下表现出优异的稳定性和催化效率，凸显了蛋白质支架的保护作用。总体而言，本研究提供了一种有效的精胺生产策略，并强调了蛋白质工程和合成生物学在提升工业用生物催化过程方面的潜力。
引言
精胺是一种天然的多胺化合物，具有多种重要的生理功能，包括抗衰老作用[1]、增强自噬作用、保护心血管系统以及调节基因表达[3]。精胺的生物合成方法因其温和的反应条件、环保的过程和易于分离的产品而受到广泛关注。我们实验室之前已经使用S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、脱羧酶（SpeD）和精胺合成酶（SpeE）在体外合成了精胺。在反应过程中，通过SpeE的作用，腐胺被转化为精胺[4]。由SpeD催化的S-腺苷甲硫氨酸反应产生的产物可以为腐胺提供氨基丙基残基[5]。尽管可以使用这种方法合成精胺，但反应时间较长[6]。
在自然过程中，酶在多酶复合体内发挥作用。底物通道化使得反应中间体能够高效地从一个酶传递到下一个酶，从而提高反应速度和催化效率[7]、[8]。这种现象使得不稳定的或有毒的反应中间体能够快速转化，并使可逆反应朝期望的方向高效进行[9]。已经开发并使用了许多构建多酶复合体的方法。其中一种方法是直接通过基因表达来构建多酶复合体。酶的遗传编码通过肽连接器依次连接，表达后形成融合的多酶蛋白[10]。另一种方法是分别表达每个目标蛋白，然后将它们组装成多酶复合体。这种策略通常依赖于天然存在的蛋白质相互作用对，例如纤维素体中的dockerin-cohesin结构域。通过将每个目标基因与相互作用对的一个组分融合，蛋白质可以通过其内在的结合相互作用自组装成多酶复合体[11]、[12]。
You和Zhang[13]将三磷酸异构酶、醛缩酶和果糖1,6-二磷酸酶与三种不同的dockerin融合。随后，通过蛋白质对将相应的三种cohesin连接起来，形成一个支架，使三种酶按预定顺序自组装在其上。结果，组装后的复合体的反应速率高于自由酶系统[13]。这种方法使得一个完整的催化单元能够有序地组装成多酶复合体，从而能够催化多步骤反应。然而，一个问题是在细胞中复合体仍然以分散的形式存在。
Zhang等人[14]采用了另一种策略来组装多种酶。他们使用了乙醇胺利用（Eut）细菌微区室（BMC）壳蛋白（EutM），这种蛋白在过表达时可以自聚形成纤维结构。他们将其与自组装的SpyTag-SpyCatcher蛋白对结合，将醇脱氢酶和胺脱氢酶同时固定在EutM纤维支架上[14]。这种方法通过聚集组装过程提高了酶的稳定性。然而，这种方法的遗传配对具有较高的随机性。
本研究结合了上述两种方法的优点。SpeE和SpeD分别与CohesinⅡ和DockerinⅡ融合，实现了双酶复合体的有序组装。这种方法增强了两种酶之间的底物通道化，提高了精胺的合成效率。在此基础上，选择了来自蓝细菌的羧体壳蛋白CcmK2作为支架[30]。通过使用SpyTag-SpyCatcher蛋白对，双酶复合体进一步以聚集的形式组装在CcmK2上，形成了更加紧凑的精胺合成蛋白结构，提高了复合体的稳定性。
章节片段
菌株和培养基
表S1列出了本研究中使用的菌株。这些菌株在LB培养基（10克/升蛋白胨、5克/升酵母提取物和5克/升氯化钠）中培养，并添加了卡那霉素（Kan，50毫克/升）或氨苄西林（Amp，100毫克/升）。
质粒构建
表S1列出了本研究中构建的质粒，表S2列出了本研究中使用的引物（由SnapGene设计）。我们从Synechocystis中选择了CcmK2蛋白，从Streptococcus pyogenes中选择了SpyCatcher-SpyTag蛋白对，从E. coli MG1655中选择了SpeE和SpeD
SpeE-SpeD双酶复合体的设计与合成
我们的实验室已经在体外通过SpeE和SpeD双酶级联系统合成了精胺。然而，较长的催化时间令人不满意，自由酶系统的催化反应需要8小时才能达到终点。在缺乏相互作用蛋白对的SpeE和SpeD（自由酶系统）中，酶与底物和中间体的接触时间过长，导致催化时间延长。因此，如果改进...
讨论
目前精胺主要通过三种方法获得：天然提取、化学合成和生物合成。天然化合物通常从豆类、小麦和海藻等植物中提取，但其天然产量有限，通常只有微克级别[19]。化学合成可以实现精胺的大规模生产。然而，它涉及多个反应步骤，并且不可避免地需要大量使用溶剂，如四氢呋喃（THF）等。
结论
精胺作为一种天然多胺，在医疗保健领域因其延长寿命的作用和潜在的癌症治疗应用而受到重视。在本研究中，我们构建了一个自组装的SpeE-SpeD多酶复合体，从腐胺生成精胺，解决了自由酶系统反应时间长和速率慢的问题。与自由酶相比，双酶复合体完成反应所需的时间从8小时缩短至3小时，反应效率也得到了提高。
CRediT作者贡献声明
Kequan Chen：监督。
Xin Wang：资源提供。
Sheng Xu：监督、项目管理和资金获取。
Yi Liu：数据管理。
Xinfeng Hu：方法学设计、数据管理。
Jiao Feng：监督。
Jiaxiang Yuan：撰写初稿、数据管理。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了江苏省基础研究计划（编号BK20233003）的资助。
