葡萄卷叶病毒13的遗传变异分析及其p23蛋白的特性

《Plant Physiology and Biochemistry》：Analysis of Genetic Variability in Grapevine Leafroll-Associated Virus 13 and the Characteristics of the p23

GLRaV-13基因组测序及p23蛋白功能研究显示，该病毒在34/234样本中检出，通过HTS、RT-PCR和RACE获得完整基因组，Y2H和BiFC揭示九对蛋白互作，p23自互作并抑制RNA沉默。N端1-178氨基酸及K99位关键，异源表达诱导 hypersensitive response，首次阐明p23通过二聚化依赖机制协同RSS活性。

　　葡萄藤叶卷相关病毒13（GLRaV-13）是一种近年来被发现的新型病毒，它主要感染葡萄植株，但此前关于其基因序列特征和功能的研究相对较少。本研究通过对34个葡萄样本进行检测，成功获得了三个中国分离株的完整基因组序列，并利用高通量测序（HTS）、重叠RT-PCR和RACE技术完成了这一目标。此外，通过酵母双杂交（Y2H）和双分子荧光互补（BiFC）实验，揭示了GLRaV-13编码的蛋白质之间的相互作用关系。研究发现，共有九对蛋白质发生相互作用，其中p23蛋白具有自我相互作用的能力。进一步的实验表明，p23蛋白在GLRaV-13中具有RNA沉默抑制（RSS）的功能，通过利用农杆菌介导的RNA沉默技术，我们确认了p23蛋白的作用机制。实验还表明，当p23蛋白通过pGD或马铃薯病毒X（PVX）载体在烟草脆皮病植物（Nicotiana benthamiana）中异源表达时，可以诱导显著的过敏反应（HR）和系统性坏死，这表明该蛋白在病毒致病机制中扮演着至关重要的角色。删除分析进一步揭示，p23蛋白的N端1-178个氨基酸区域是其自我相互作用和RSS活性的关键区域。突变分析则显示，位于p23蛋白第99位的赖氨酸（K）残基在p23二聚化、与其他蛋白的特异性相互作用、RSS功能以及致病性方面起着决定性作用。研究结论指出，p23蛋白通过依赖二聚化的机制发挥其症状加剧功能，这一机制与RNA沉默抑制活性密切相关。

RNA沉默是一种普遍存在于植物中的基因调控机制，它在抗病毒防御和更广泛的免疫反应中起着关键作用。RNA沉默指的是通过Dicer-like（DCL）酶将双链RNA（dsRNA）切割成小干扰RNA（siRNA），然后这些siRNA与argonaute（AGO）蛋白结合，形成RNA诱导的沉默复合体（RISC），从而在目标RNA的转录水平上实现转录后基因沉默（PTGS）或转录基因沉默（TGS）。对于葡萄藤叶卷相关病毒（GLRaVs）而言，RNA沉默抑制因子（RSS）通常位于病毒基因组的3'端。例如，葡萄藤叶卷相关病毒1和2（GLRaV-1和2）编码的p24蛋白，以及葡萄藤叶卷相关病毒3（GLRaV-3）编码的P19.7蛋白，已被鉴定为RNA沉默抑制因子。葡萄藤病毒编码的RNA沉默抑制因子能够与植物中的RNA沉默机制相互作用，并干扰其正常功能。例如，GLRaV-2的p24蛋白通过与葡萄藤转录因子RAV1（VvRAV1）相互作用，增强了其对植物抗病毒RNA沉默的抑制作用，从而劫持了一部分核定位的VvRAV1并暴露其RNA结合功能域。

结构分析和Y2H或BiFC实验揭示了不同植物病毒中RNA沉默抑制因子的寡聚化现象。越来越多的研究表明，某些RNA沉默抑制因子能够形成同源二聚体或寡聚体，例如烟草卷叶病毒（TbCSV）的V2蛋白、GLRaV-2的p24蛋白、番茄不孕病毒（TAV2）的2b蛋白以及番茄叶卷中国病毒（ToLCCNV）的βC1蛋白。特定的序列模因或氨基酸在这些RNA沉默抑制因子的二聚体或寡聚体形成中起着关键作用。例如，TbCSV的V2蛋白在第43位的精氨酸（R）对于其在植物中的自我相互作用至关重要。GLRaV-2的p24蛋白需要AA 10-180或1-170区域来实现二聚化。此外，甘蓝病毒（TuMV）的HC-Pro蛋白的中央和C端区域与自我相互作用有关。

葡萄藤是家族Vitaceae中最早被驯化的多年生木本果树之一，具有极高的经济价值，并受到多种病毒的侵染，其中包括严重影响葡萄园经济的病毒。目前，已有102种不同属和科的病毒在葡萄中被报道，未来可能会发现新的病毒种类。葡萄藤叶卷病（GLD）是由家族Closteroviridae的媒介病毒引起的复杂病害，存在于全球所有葡萄酒产区，并被认为是影响葡萄和葡萄酒生产最严重的病毒复合体。六种与叶卷病相关的GLRaV中，GLRaV-1、-3、-4和-13属于Ampelovirus属，而GLRaV-2和-7则分别属于Closterovirus属和Velarivirus属。

2016年，在日本发现的一株表现出葡萄藤叶卷病的葡萄样本（编号a177）中，分离出了一种新的病毒，并被命名为GLRaV-13。该病毒的完整基因组由17,608个核苷酸组成，包含11个开放阅读框（ORFs）。基于其基因组结构和聚类分析，该病毒被归类为Ampelovirus属。2019年，GLRaV-13首次在中国被报道，并且仅在阿穆尔葡萄样本中被检测到。然而，截至目前，尚未有关于在中国分离的、具有验证和完整5'和3'端的GLRaV-13病毒全基因组序列的报道。此外，关于GLRaV-13编码的蛋白质之间的相互作用和功能的研究也尚未进行。

本研究中，我们成功获得了三个GLRaV-13分离株的完整基因组序列，并探讨了其编码蛋白质之间的相互作用网络。研究结果表明，GLRaV-13的p23蛋白具有RNA沉默抑制功能，并能够实现自我相互作用。进一步实验表明，当通过PVX载体在烟草脆皮病植物中异源表达p23蛋白时，可以诱导特征性的过敏反应和系统性坏死。这种致病表型严格依赖于p23蛋白的RNA沉默抑制活性和二聚化能力。更为重要的是，我们首次揭示了位于p23蛋白第99位的氨基酸残基在协调p23蛋白自我相互作用、聚集形成、RNA沉默抑制活性和致病性方面的关键作用。这一调控网络建立了一种新的分子机制，解释了p23蛋白的多种功能。

在本研究中，我们收集了来自中国不同地区的234株葡萄样本，并将其保存在国家落叶果树脱毒中心（中国农业科学院果树研究所，辽宁省兴城市）。通过这些样本，我们分析了GLRaV-13的遗传变异情况。研究还发现，p23蛋白在GLRaV-13中不仅具有自我相互作用的能力，还能够在异源表达条件下引发显著的过敏反应和系统性坏死。这一现象进一步表明，p23蛋白在病毒的致病过程中起着核心作用。

在本研究中，我们还对p23蛋白的基因序列进行了分析，并将其提交至GenBank数据库。研究结果显示，p23蛋白的序列在不同葡萄样本中表现出一定的变异，但其核心结构保持一致。此外，我们还对这些分离株的来源和症状进行了详细记录，并将其整理在表格S5中。通过对这些序列的筛选和分析，我们排除了那些内部同源性超过98%的序列，从而确保了研究结果的准确性。

本研究的讨论部分进一步指出，此前GLRaV-13仅在日本的阿穆尔葡萄样本中被检测到，而在本研究中，它被发现存在于超过30种不同的葡萄品种中。这一发现表明，GLRaV-13在不同葡萄品种中的分布可能比之前认为的更为广泛。此外，本研究中获得的GLRaV-13病毒全基因组序列具有验证的5'和3'端，这是目前在中国尚未报道的。在本研究中，我们通过RT-PCR结合RACE技术获得了这一全基因组序列，并且发现仅本研究中的YG分离株和之前报道的日本LC746719分离株包含10个开放阅读框。这一发现为理解GLRaV-13的基因组结构提供了新的视角。

本研究的结论部分强调，这是目前第一项全面研究和描述GLRaV-13基因序列变异以及其编码蛋白质生物功能的研究。在本研究中，我们不仅深入分析了GLRaV-13的基因序列多样性，还揭示了其编码蛋白质在病毒生命周期中的关键作用。更为重要的是，我们首次成功鉴定了GLRaV-13编码的RNA沉默抑制因子。这一发现为理解GLRaV-13的致病机制提供了重要的理论基础。

本研究的CRediT作者贡献声明部分详细列出了每位研究人员在项目中的具体贡献。Tingting Du负责撰写原始稿件、可视化、验证、监督、软件开发、形式分析、数据管理以及概念设计。Xudong Fan负责撰写和审阅稿件、可视化、验证、监督、软件开发、资金获取以及概念设计。YuXin Hao负责项目管理、方法学、调查、形式分析、数据管理以及概念设计。Jie Gao负责软件开发、资源获取以及项目管理。Shane Qiao负责资源获取、项目管理以及方法学。

本研究的未引用参考文献部分列出了相关文献，包括Almeida Rodrigo等人的2013年研究、Alzhanova等人的2000年和2007年研究、Bolwell和Wojtaszek的1997年研究、Bragg和Jackson的2004年研究、Chao等人的2005年研究、Dangl和Jones的2001年研究、Ito和Nakaune的2016年研究、Lopez-Gomollon和Baulcombe的2022年研究、Napuli等人的2000年研究、Prokhnevsky等人的2002年研究、Rosa等人的2018年研究、Satyanarayana等人的2000年研究、Wang等人的2005年研究、Ye和Patel的2005年研究以及Zhou等人的2024年研究。

本研究的声明部分表明，作者们声明他们没有已知的可能影响研究结果的财务利益或个人关系。此外，作者们还声明，他们没有发现其他可能影响研究结果的财务利益或个人关系。研究的致谢部分表明，本研究得到了中国农业科学院农业科研系统（CARS-29-bc-1）、宁夏回族自治区重点研发计划（2024BBF01002）以及中国农业科学院农业科技创新计划（CAAS-ASTIP-RIP）的支持。此外，pGD载体是由中国农业大学的Cheng Yuqin教授提供的。这些支持和资源为本研究的顺利进行提供了保障。