血浆蛋白质组学平台比较研究：Olink Explore 3072与肽段分级质谱的互补性与定量一致性分析

《Communications Chemistry》：Comparative evaluation of Olink Explore 3072 and mass spectrometry with peptide fractionation for plasma proteomics

本研究针对血浆蛋白质组学技术平台选择对研究结果影响不明的问题，系统比较了基于肽段分级的质谱方法（HiRIEF LC-MS/MS）与Olink Explore 3072邻近延伸分析技术在88例血浆样本中的性能。研究发现两种平台具有互补的蛋白质组覆盖度、高精密度和一致的性别差异估计，定量相关性中等（中位Spearman相关系数0.59），并开发了PeptAffinity工具用于肽段水平分析。该研究为平台选择提供了重要依据，强调了质谱与亲和方法的联合应用可实现更全面可靠的血浆蛋白质组分析。

　　

在精准医疗时代，血浆蛋白质组作为反映个体生理状态和疾病过程的"分子窗口"，已成为生物标志物发现的重要源泉。然而，血浆蛋白质组的极端复杂性——蛋白质浓度跨越10个数量级，且22种高丰度蛋白占蛋白质总量的99%——使得低丰度疾病相关蛋白的检测面临巨大挑战。近年来，基于质谱（MS）的全局蛋白质组学技术和基于亲和力的高度多重蛋白质组学技术（如Olink的邻近延伸分析PEA）的快速发展，为大规模血浆蛋白质组分析提供了新的可能。但不同技术平台在蛋白质定量、可重复性和生物学解释方面的差异，却鲜有系统比较。

针对这一关键问题，由瑞典卡罗林斯卡学院的Noora Sissala领衔的研究团队在《Communications Chemistry》上发表了最新研究成果，对肽段分级质谱（HiRIEF LC-MS/MS）与Olink Explore 3072 PEA平台进行了全面比较。研究团队分析了88例血浆样本，共检测到4362种蛋白质，其中1129种蛋白质可由两种平台共同检测，为深入评估平台性能提供了丰富数据。

关键技术方法包括：采集114例肺癌疑似患者诊断前血浆样本，通过高丰度蛋白去除、胰蛋白酶消化、TMT标记、高分辨率等电聚焦（HiRIEF）分馏和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析进行深度蛋白质组分析；同时使用Olink Explore 3072平台对88例样本进行多重蛋白分析；通过技术变异系数评估精密度，差异丰度分析评估统计效能，相关性分析评估平台一致性，并开发PeptAffinity工具进行肽段水平分析。

蛋白质组覆盖度互补性强

研究显示，HiRIEF LC-MS/MS与Olink Explore 3072在血浆蛋白质组覆盖度上表现出明显互补性。MS方法检测到2578种独特蛋白质，Olink平台检测到2913种，其中1129种为重叠蛋白质。MS方法与参考血浆蛋白质组（4889种蛋白质）重叠度更高，而Olink平台检测到1000多种未在基于MS的研究中报告的蛋白质。

两种技术检测的蛋白质浓度跨越10个数量级，低至皮克/毫升级别。Olink对低丰度蛋白质的覆盖度更高，而MS对中高丰度蛋白质的覆盖度更优。MS数据中缺失值更为常见，72%的蛋白质至少有一个缺失值，而Olink数据中这一比例为35%。低丰度蛋白质在MS数据中常有大量缺失值，凸显了不同平台在不同浓度范围内的检测优势。

检测蛋白质特征差异显著

基于HPA注释的分析发现，MS数据中预测的分泌蛋白、酶、代谢蛋白、免疫球蛋白、肝脏组织富集蛋白和潜在药物靶点更为常见；而Olink数据中预测的膜蛋白、CD标记物、男性生殖系统分泌蛋白以及大脑和睾丸富集蛋白更为频繁。

基因本体（GO）分析显示，MS富集了与高丰度血浆蛋白相关的生物学过程——止血、血液凝固、补体激活和代谢；而Olink富集了与低丰度信号蛋白特别是细胞因子相关的过程。两种方法检测的美国食品药品监督管理局（FDA）批准的血浆蛋白生物标志物数量相当（MS为79种，Olink为72种，共99种），其中55种由两种平台共同检测。

技术精密度与统计效能评估

两种平台均表现出高精密度，MS的技术变异系数（CV）中位数为6.8%，Olink为6.3%。大多数蛋白质在两种数据集中的CV均低于15%（MS：85%，Olink：81%）。

在评估性别差异的差异丰度分析中，考虑所有重叠蛋白质时，MS和Olink分别鉴定出68和210个差异丰度蛋白质（DAP），其中50个（24%）由两种平台共同鉴定。当限制分析无缺失值的重叠蛋白质（569个）时，两种平台分别鉴定出82和118个DAP，其中53个（36%）共同鉴定。尽管鉴定的DAP数量不同，但两种平台在估计差异的方向和大小上表现出强一致性，相关性达R=0.93，方向一致性达95%。

平台间定量相关性分析

MS和Olink测量之间的定量一致性通过Spearman相关系数评估。所有重叠蛋白质（1129个）的中位相关性为ρ=0.59，近三分之二呈现中度至强相关性（ρ∈[0.5,1.0]）。在去除缺失值、低于检测限（LOD）值和质控警告的463个蛋白质子集中，中位相关性提高至ρ=0.68，81%的蛋白质呈现中度至强相关性。

0.5且两种平台均检测到cis-pQTL的蛋白质；层级2包括相关性≤0.5但两种平台均检测到cis-pQTL的蛋白质；层级3包括仅一或两种平台均未检测到cis-pQTL的蛋白质。虚线表示研究间完全一致（斜率=1）。图边缘密度图显示各置信层级的相关性分布，虚线表示各层级中位数。'>

技术因素对平台间相关性有显著影响。MS中缺失值比例和Olink中<>

肽段水平分析阐明蛋白质异构体差异

研究团队开发了PeptAffinity工具，用于可视化MS肽段与对应Olink检测沿蛋白质序列和结构的相关性。肽段水平分析揭示了平台间在蛋白质异构体检测上的差异。

以AMBP基因为例，其编码的前体蛋白裂解为两个功能产物：α1-微球蛋白和inter-α-胰蛋白酶抑制剂（IαI）轻链。映射到α1-微球蛋白区域的肽段与AMBP Olink检测的相关性（中位ρ=0.53）强于IαI轻链区域（中位ρ=0.07），表明Olink检测主要测量α1-微球蛋白蛋白质异构体。类似地，CD99分析显示，映射到胞内域的肽段与CD99 Olink检测的相关性（中位ρ=0.12）低于胞外域（中位ρ=0.64），表明测量的CD99血浆蛋白水平主要反映短异构体。

研究意义与展望

这项研究通过深入分析4362种蛋白质（1129种重叠）的血浆蛋白质组，揭示了基于肽段分级的质谱与Olink Explore 3072平台的互补优势。研究表明，两种技术联合应用可提供比单一方法更全面的血浆蛋白质组分析，增加生物学和临床相关发现的可能性。

研究强调，平台选择应基于研究具体目标和技术优势。Olink平台在分析低丰度、组织渗漏和信号蛋白方面具有优势，适合大规模研究；而MS的非靶向特性为发现性研究提供显著优势，可全面表征不同条件下的血浆蛋白质组，检测新蛋白质和翻译后修饰（PTM）。

肽段水平分析平台间差异的能力，展示了从基因或蛋白质中心分析转向蛋白质异构体中心分析的重要性。不同蛋白质异构体可能具有不同细胞功能、定位或疾病作用，精确测量它们可推动生物标志物发现和药物开发。

该研究为至少三分之一的Olink Explore 3072检测的准确性和特异性提供了正交验证，基于与HiRIEF LC-MS/MS测量的强一致性。同时强调，需要在大样本量的MS分析中验证基于亲和力方法检测的蛋白质数量性状基因座（pQTL），以建立更可靠的血浆蛋白质组分析标准。

随着血浆蛋白质组学技术的不断进步，联合应用多种平台策略将有助于更全面、可靠地分析血浆蛋白质组，为疾病机制研究和精准医疗提供更强大的工具。未来工作将受益于评估不同血浆蛋白质组学数据插补方法的可比性，以及探索样品制备方案、检测版本、仪器和数据处理如何影响与基于亲和力方法的定量一致性。