斑马鱼心脏瓣膜蛋白聚集致慢性心力衰竭模型：DsRed聚集诱导房室瓣增厚的新机制

《Communications Biology》：A zebrafish model of chronic heart failure caused by protein aggregation in heart valves

本研究针对瓣膜性心脏病导致慢性心力衰竭(CHF)的机制研究缺乏理想动物模型的问题，开发了表达红色荧光蛋白DsRed的转基因斑马鱼模型"tomato"。研究发现DsRed在房室瓣(AV)异常聚集引发炎症反应、上皮-间质转化(EMT)和细胞增殖，导致瓣膜增厚、血液反流和心房扩大，呈现典型CHF特征。通过Cre-loxP系统去除DsRed可逆转心脏缺陷，证实了DsRed聚集的关键作用。该模型为研究瓣膜性心脏病和心力衰竭提供了新平台，对药物筛选和疗法开发具有重要意义。

　　

在心血管疾病研究领域，慢性心力衰竭(CHF)作为各种心脏疾病的终末阶段，严重威胁人类健康。其中，瓣膜性心脏病是导致心力衰竭的重要诱因，但关于瓣膜功能障碍如何逐步发展为心力衰竭的分子机制仍不明确。传统动物模型往往只能模拟心力衰竭病理机制的单一环节，且多集中在胚胎期或幼年期表现症状，缺乏能够完整再现人类慢性心力衰竭渐进性病理特征的理想模型。

在这一研究背景下，日本京都大学的研究团队意外发现了一种名为"tomato"的转基因斑马鱼，该品系斑马鱼在色氨酸羟化酶2(tph2)启动子控制下表达红色荧光蛋白DsRed。令人惊讶的是，随着斑马鱼生长发育，这些tomato斑马鱼逐渐出现心脏扩张和类似慢性心力衰竭的症状，为研究瓣膜性心脏病提供了全新的动物模型。

研究人员发现，tomato斑马鱼在生长发育过程中表现出明显的心脏扩大现象。与野生型(WT)斑马鱼相比，tomato斑马鱼的生存率显著降低（73.3%对95.5%），成年期心率明显下降（平均91次/分对104次/分），心脏衰竭标志物利钠肽B(NPPB)表达水平升高2.15倍。超声心动图检测发现tomato斑马鱼存在血液反流现象，提示瓣膜功能异常。

心脏形态学分析显示，tomato斑马鱼的心脏扩大主要表现为心房扩张，早在1月龄时就已出现，并随着发育进程而加剧。组织学检查发现房室瓣(AV)明显增厚，心肌纤维排列紊乱且结构松散。这些结构改变解释了为何会出现瓣膜关闭不全和血液反流。

为了深入探究瓣膜增厚的机制，研究人员对心脏组织进行RNA测序(RNA-seq)分析。结果显示，tomato斑马鱼心脏中有1208个基因表达上调，619个基因表达下调。基因本体分析发现炎症反应、肿瘤坏死因子-α(TNFα)信号通路、白细胞介素2(IL-2)-STAT5信号通路、上皮-间质转化(EMT)和细胞增殖相关通路显著激活。

免疫组化分析进一步证实，tomato斑马鱼房室瓣区域的上皮-间质转化标志物波形蛋白(vimentin)和细胞增殖标志物增殖细胞核抗原(PCNA)表达增加，表明该区域细胞增殖和分化活动活跃。

关键发现在于，研究人员通过荧光显微镜和免疫组化检测到DsRed蛋白在tomato斑马鱼的房室瓣和球室瓣(BV)区域特异性聚集。为验证DsRed聚集与心脏表型的因果关系，研究团队利用Cre-loxP系统特异性去除DsRed表达基因。实验结果显示，注射Cre mRNA的胚胎不表达红色荧光，且成年后不出现心脏缺陷，明确证实DsRed聚集是导致心脏异常的关键因素。

本研究采用多项关键技术方法：通过Tol2转座酶介导的转基因技术建立tomato斑马鱼品系；利用超声多普勒成像评估心脏功能和血流动力学；进行组织学分析（Masson三色染色、H&E染色）观察心脏结构变化；采用RNA测序和qPCR分析基因表达谱；通过免疫组化检测蛋白定位和表达；应用Cre-loxP系统进行基因编辑验证；开展全基因组测序(WGS)分析转基因插入位点。实验使用3月龄斑马鱼为研究对象，WT和tomato组各设多个生物学重复。

Generation and identification of the tomato transgenic line

研究人员开发了tomato转基因斑马鱼品系，该品系在tph2启动子控制下表达DsRed。育种实验显示转基因插入与心脏扩大表型紧密相关，所有tomato斑马鱼均出现心脏扩大，而野生型斑马鱼无此表型。

Survival rate and physiological characteristics of tomato zebrafish

tomato斑马鱼生存率显著低于野生型（73.3%对95.5%），成年期心率降低，心脏衰竭标志物nppb表达上调2.15倍。超声心动图检测到血液反流，表明瓣膜功能异常。

Cardiac morphological changes in tomato zebrafish

心脏形态学分析发现tomato斑马鱼主要表现为心房扩张，房室瓣明显增厚。组织学检查显示心房心肌纤维排列紊乱，结构重塑。

Mechanisms of AV valve thickening in tomato zebrafish

RNA测序分析显示，tomato斑马鱼心脏中炎症反应、上皮-间质转化(EMT)和细胞增殖相关通路显著激活。免疫组化证实房室瓣区域波形蛋白和PCNA表达增加。

DsRed accumulation and its implications in the AV valve of tomato zebrafish

荧光检测发现DsRed在房室瓣和球室瓣区域特异性聚集。Cre-loxP介导的DsRed去除实验成功挽救了心脏缺陷表型，证实DsRed聚集是致病关键因素。

Exploration of the transgene insertion site via whole genome sequencing(WGS)

全基因组测序分析表明转基因以多拷贝形式插入，但精确插入位点因序列多重比对特性而未能确定。

研究讨论部分强调，该研究首次揭示了DsRed蛋白在斑马鱼心脏组织中的体内聚集效应。与以往认识不同，瓣膜增厚主要由上皮-间质转化、细胞增殖和炎症反应驱动，而纤维化作用较小，这可能与斑马鱼独特的心脏再生能力有关。研究还指出，DsRed的聚集特性虽常被视为应用劣势，但本研究成功将其转化为建立疾病模型的独特优势。

该斑马鱼模型模拟了人类瓣膜性心脏病的渐进性发展过程：DsRed在房室瓣聚集（14天）→瓣膜增厚→瓣膜功能不全→心房扩大（30天）→心脏衰竭表现（3月龄）。这种渐进性心脏表型与以往报道的早期表现心力衰竭的斑马鱼模型有显著区别，更适合研究衰老相关心力衰竭。

值得注意的是，瓣膜中异常蛋白聚集导致瓣膜性心脏病在临床实践中已有相关报道，如淀粉样变性在心脏瓣膜的沉积、黏多糖贮积症患者二尖瓣上的糖胺聚糖聚集等。这些病理改变与本研究观察到的DsRed聚集引起的瓣膜增厚、血液反流、心房扩大和舒张功能不全等表型相似，表明该模型具有重要的临床相关性。

本研究发表在《Communications Biology》杂志，为研究瓣膜性心脏病和慢性心力衰竭提供了新的动物模型平台。该模型不仅有助于阐明蛋白质聚集导致瓣膜功能障碍的分子机制，还为筛选治疗瓣膜性心脏病的新型药物和开发创新疗法提供了有价值的研究工具。特别是其渐进性发病特点和成年期表型，使其成为研究人类心脏瓣膜疾病进展机制的理想模型系统。