单细胞转录组图谱阐明了山羊毛囊中的毛发生长周期和细胞凋亡机制

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：A single-cell transcriptomic atlas elucidates the hair cycle and apoptosis mechanisms in goat hair follicles

单细胞转录组测序揭示山羊毛发生长周期中毛乳头细胞凋亡的分子机制，发现Wnt信号通路和凋亡相关基因在毛乳头细胞中富集，动态基因KRT19和API5及调控因子MSX2和LEF1对细胞命运决定起关键作用，并构建了高分辨率细胞图谱。

　　本研究通过单细胞转录组测序技术，深入探讨了山羊毛囊细胞凋亡的分子机制。研究团队从山羊毛囊的生长期（Anagen）、退行期（Catagen）和休止期（Telogen）三个阶段中，收集了8,214个毛囊细胞样本，并成功识别出九种主要的细胞类型。其中，基质细胞（Matrix cells, MCs）在Wnt信号通路和细胞凋亡相关基因的表达上具有显著特征。进一步的分析揭示了决定MCs命运的关键动态基因（如KRT19、API5）以及调控因子（如MSX2、LEF1），为理解毛囊细胞凋亡的生物学过程提供了新的视角，并可能为毛囊凋亡相关的诊断标志物提供依据。

毛囊作为皮肤的附属器官，其结构和功能在毛发生长周期中经历了显著的变化。毛囊的发育过程与多种信号调控密切相关，而这些信号的动态变化决定了细胞在不同阶段的活性和功能。在生长期，毛囊细胞持续增殖，形成新的毛发；而在退行期，细胞开始凋亡，毛囊逐渐退化；休止期则是细胞活动相对静止的阶段。细胞凋亡不仅影响毛囊的结构变化，还与毛发质量、产量及动物整体健康密切相关。因此，研究毛囊凋亡的分子机制，有助于揭示其在毛发生长周期中的作用，并为提高山羊绒毛的产量和质量提供科学依据。

传统测序技术通常以组织为单位进行分析，这在一定程度上掩盖了复杂组织中细胞的异质性。而单细胞测序技术能够突破这一局限，通过单个细胞的基因表达分析，揭示不同细胞类型的特异性表达模式。这一技术的应用使得研究人员能够更精确地识别毛囊细胞的类型，并进一步分析其在不同发育阶段的基因表达变化。研究团队采用单细胞转录组测序技术，构建了山羊毛囊细胞在不同周期阶段的高分辨率细胞图谱，为未来毛囊相关研究提供了重要的基础数据。

在实验方法上，研究团队首先从三只24个月龄的内蒙山羊身上采集了背部皮肤组织，随后通过一系列预处理步骤，包括组织清洗、消化、机械分离等，最终获得了单细胞悬液。通过10x Genomics平台进行单细胞RNA测序，并利用CellRanger软件对原始测序数据进行了处理和质量控制。研究团队对测序数据进行了标准化处理，并筛选出每个细胞簇中的关键基因。随后，采用Seurat软件对不同发育阶段的细胞进行了聚类分析，以识别其基因表达特征。通过整合不同时间点的测序数据，研究团队进一步使用RunMultiCCA方法对细胞进行比较分析，以揭示其在毛囊周期中的动态变化。

在细胞类型识别方面，研究团队通过t-SNE算法对不同发育阶段的细胞进行了可视化分析，最终识别出12个不同的细胞簇。这些细胞簇包括内根鞘细胞、膨突细胞、基质细胞、外根鞘细胞、真皮细胞、免疫细胞、内皮细胞、黑色素细胞以及真皮乳头细胞等。每个细胞簇的基因表达特征与其功能密切相关，例如基质细胞中富集了Wnt信号通路和凋亡相关基因，这表明其在毛囊凋亡过程中扮演了重要角色。此外，研究团队还发现了多个细胞类型特异性表达的新型标志基因，如内根鞘细胞中的TCHH和LOC102177231、膨突细胞中的CXCL14和LOC102176685等，这些基因的表达特征为毛囊细胞类型的鉴定提供了新的依据。

为了进一步分析毛囊细胞在凋亡过程中的基因表达动态，研究团队使用GO（Gene Ontology）分析对不同发育阶段的基因进行了功能注释。结果表明，不同细胞类型在毛囊周期中参与了不同的生物学过程。例如，基质细胞在退行期表现出对“Wnt信号通路”和“凋亡”等通路的高度富集，这提示基质细胞在毛囊凋亡过程中可能发挥关键作用。此外，研究团队还利用GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）对不同阶段的基因表达变化进行了系统分析，发现毛囊细胞在不同阶段的基因表达模式发生了显著变化，尤其是在退行期和休止期之间，某些基因的表达水平发生了逆转。

为了揭示基质细胞在毛囊凋亡过程中的命运变化，研究团队采用伪时间（pseudotime）分析方法，构建了基质细胞的分化轨迹。伪时间分析结果显示，基质细胞在毛囊周期中经历了复杂的动态变化，其表达模式呈现出阶段性特征。在生长期，基质细胞主要处于活跃增殖状态；而在退行期，其表达模式逐渐向凋亡方向转变，最终在休止期几乎完全消失。这种动态变化不仅反映了基质细胞在毛囊周期中的功能演变，还揭示了其在细胞迁移、分化以及凋亡过程中的潜在作用。

在基因表达动态分析中，研究团队发现了一些重要的动态基因，如KRTAP3-1、HSPA6、HSPH1等。这些基因在毛囊周期的不同阶段表现出不同的表达趋势，其中部分基因在退行期和休止期的表达水平显著下降，而另一些基因则表现出上升趋势。这些动态基因的表达变化与毛囊细胞的功能状态密切相关，例如KRTAP3-1在毛囊细胞中高度表达，可能与毛发结构的形成和维持有关。此外，API5在生长期的表达水平较高，但在退行期和休止期明显降低，这提示API5可能在调控毛囊细胞凋亡过程中起到重要作用。

为了进一步探索毛囊细胞凋亡的调控机制，研究团队利用SCENIC（Single-Cell Regulatory Network Inference and Clustering）分析方法，识别了调控毛囊细胞基因表达的关键转录因子（Transcription Factors, TFs）。结果显示，MSX2、HOXC13、LEF1和RUNX1等转录因子在基质细胞中高度激活，可能在毛囊细胞凋亡过程中发挥核心作用。MSX2在胚胎发育中起着重要作用，而HOXC13则与毛发生成和角蛋白表达密切相关。LEF1和RUNX1在转录调控方面具有重要功能，可能通过调控下游基因的表达，影响毛囊细胞的分化和凋亡过程。这些转录因子的表达变化为理解毛囊凋亡的分子机制提供了新的线索。

此外，研究团队还利用CytoTRACE分析方法，评估了毛囊细胞的分化潜力。结果显示，基质细胞的分化程度相对较低，而真皮乳头细胞、免疫细胞和真皮细胞则表现出较高的分化潜力。这一发现提示基质细胞在毛囊周期中可能具有更高的可塑性和多样性，其功能变化可能与毛囊的再生和凋亡密切相关。通过伪时间分析，研究团队进一步揭示了基质细胞在毛囊周期中的动态变化，为理解其在不同阶段的功能状态提供了新的视角。

本研究还发现，毛囊细胞凋亡过程伴随着多种信号通路的显著变化，尤其是Wnt信号通路和凋亡相关基因的表达。Wnt信号通路在毛囊发育和再生过程中起着关键作用，而其在基质细胞中的富集则可能提示其在细胞凋亡中的潜在调控功能。同时，研究团队还发现，其他重要信号通路，如TGF-β通路和EDA-EDAR-NF-κB轴，也在毛囊细胞凋亡过程中发挥了重要作用。这些信号通路的动态变化不仅影响了毛囊细胞的凋亡过程，还可能通过调控细胞增殖、分化和迁移，影响毛囊的整体发育和再生能力。

综上所述，本研究通过单细胞转录组测序技术，系统分析了山羊毛囊细胞在不同周期阶段的基因表达特征和调控机制。研究结果不仅揭示了毛囊细胞凋亡的分子基础，还为未来毛囊相关研究提供了重要的理论依据和实验数据。通过识别关键基因和信号通路，研究团队为提高山羊绒毛的产量和质量提供了新的思路和方向。此外，本研究还为理解毛囊发育和再生的生物学过程提供了新的视角，为相关疾病的诊断和治疗提供了潜在的靶点和策略。