线粒体自噬相关生物标志物及巨噬细胞在肺动脉高压中的作用：识别及其功能意义

《Frontiers in Physiology》：Mitophagy-associated biomarkers and macrophage involvement in pulmonary arterial hypertension: identification and functional implications

本研究通过整合转录组测序、单细胞RNA测序、机器学习算法及实验验证，系统探讨肺动脉高压（PAH）与线粒体自噬的关系，鉴定出RRAS、BECN1、MFN1、HIF1A和TAX1BP1五个与PAH相关的线粒体自噬标志物，并通过大鼠模型验证其表达变化与病理特征的相关性，为早期诊断和靶向治疗提供新思路。

　　### 肺动脉高压与自噬关系的系统研究

肺动脉高压（Pulmonary Arterial Hypertension, PAH）是一种具有复杂病理机制的慢性疾病，其核心特征包括肺动脉压力的持续升高以及肺血管重塑、炎症反应和右心室功能障碍等。尽管近年来在诊断和治疗方面取得了显著进展，但PAH的发病机制仍未完全明确，这使得其临床管理面临较大挑战。当前的治疗手段在逆转疾病进展方面效果有限，患者预后仍较差，因此，探索PAH的分子机制并识别可靠的生物标志物，对于早期诊断和开发新的治疗策略具有重要意义。

近年来，越来越多的研究表明，线粒体质量调控机制在PAH的发生发展中起着关键作用。其中，自噬（autophagy）作为细胞内一种重要的清除机制，其特定形式——线粒体自噬（mitophagy）——在维持线粒体稳态和细胞功能方面具有特异性。然而，尽管已有研究指出自噬功能障碍可能与PAH有关，但具体的机制和相关的生物标志物仍缺乏系统性的研究。为此，本研究采用整合分析的方法，结合批量转录组分析、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、机器学习算法以及实验验证，深入探讨自噬与PAH之间的关联，并识别出具有潜在诊断价值的生物标志物。

### 研究方法与数据整合

研究首先从公开的微阵列数据集中提取差异表达基因（DEGs），并将其与MitoCarta 3.0数据库中收录的自噬相关基因（MRGs）进行交集分析。随后，通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）和五种不同的机器学习模型，筛选出五个与自噬相关的候选生物标志物：RRAS、BECN1、MFN1、HIF1A和TAX1BP1。这些基因在训练集和验证集中均表现出优异的诊断性能（AUC > 0.9），提示其在PAH中的重要性。

此外，研究通过免疫细胞去卷积分析发现，PAH患者的肺组织中M1巨噬细胞浸润显著增加。scRNA-seq进一步揭示了这些生物标志物主要在单核细胞/巨噬细胞群体中表达，并显示出在巨噬细胞分化过程中的不同表达轨迹。为了验证这些生物标志物的表达水平及其与自噬和炎症标志物的共定位，研究还采用了定量PCR、Western blot和免疫荧光等实验手段，在单甲基肼（monocrotaline, MCT）诱导的PAH大鼠模型中进行了系统分析。

### 研究结果与结论

研究结果表明，自噬在PAH的病理生理过程中起着重要作用。通过生物信息学分析和体内验证，五个候选生物标志物在PAH患者的肺组织中表现出显著的表达变化，其中RRAS在PAH组中上调，而BECN1、HIF1A、MFN1和TAX1BP1则下调。这提示这些基因可能在不同自噬状态中发挥不同的作用，从而影响肺血管重塑和炎症反应。

进一步的功能注释分析显示，这些生物标志物不仅与自噬相关，还与多个生物学通路存在显著关联，包括剪接体通路和神经活性配体-受体相互作用通路。这表明它们可能在维持细胞稳态、调控炎症反应和影响血管结构中具有重要作用。此外，免疫细胞浸润分析揭示了PAH与免疫微环境之间的密切联系，其中M1巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、活化的自然杀伤细胞（NK cells）、活化的树突状细胞（DCs）和CD8+ T细胞在PAH患者的肺组织中显著增加，提示这些免疫细胞可能在疾病进展中扮演重要角色。

在单细胞RNA测序数据的分析中，研究发现巨噬细胞是PAH相关细胞群中最显著的组成部分。通过伪时间轨迹分析，研究进一步揭示了这些细胞在分化过程中的动态变化，以及生物标志物在不同细胞状态下的表达模式。例如，BECN1、MFN1和RRAS的表达相对稳定，而TAX1BP1的表达则随伪时间逐渐增加，HIF1A的表达在早期达到峰值后下降。这提示这些生物标志物可能在不同阶段调控自噬和巨噬细胞功能，从而影响疾病进程。

### 生物标志物的功能验证与免疫调控

为了进一步验证这些生物标志物的功能，研究采用定量PCR、Western blot和免疫荧光等方法，在MCT诱导的PAH大鼠模型中检测其表达水平。结果显示，RRAS在PAH组中显著上调，而BECN1、HIF1A、MFN1和TAX1BP1则显著下调。此外，免疫荧光双标记分析显示，LC3和iNOS的共定位在PAH组中显著增强，提示自噬与炎症反应之间存在密切的相互作用。这些结果支持了生物标志物在调控自噬和免疫反应中的潜在作用。

进一步的分析还发现，RRAS与iNOS之间存在正相关，而BECN1、MFN1、HIF1A和TAX1BP1则与iNOS呈负相关。这表明这些基因可能在不同层面调控巨噬细胞的极化状态，进而影响炎症反应和血管重塑。此外，通过PPI网络分析，这些生物标志物被识别为自噬与PAH之间的重要枢纽，提示它们在疾病发展中的关键作用。

### 研究的临床意义与未来方向

本研究的发现为理解PAH的分子机制提供了新的视角，并为开发针对PAH的诊断和治疗策略奠定了基础。识别出的五个生物标志物具有较高的诊断潜力，其表达水平可以作为评估PAH病情的潜在指标。然而，目前的研究主要基于肺组织的分析，而肺活检并非常规临床检查手段，这限制了其在实际应用中的可行性。

因此，未来的研究应关注这些生物标志物在血液样本中的表达情况，尤其是外周血单核细胞（PBMCs）中是否存在类似的表达模式。如果能够确认这些标志物在PBMCs中的表达与肺组织中的表达一致，那么它们有望成为非侵入性检测PAH的潜在生物标志物。此外，由于PAH具有高度的异质性，未来的研究还需要进一步细分患者群体，以更准确地识别与特定亚型相关的生物标志物。

### 研究的局限性与展望

尽管本研究在揭示自噬与PAH之间的关系方面取得了重要进展，但仍存在一些局限性。首先，PAH的异质性可能导致生物标志物的表达模式在不同患者之间存在差异，因此，未来的研究需要采用更精细的分层分析方法，以提高标志物的特异性。其次，目前的研究主要依赖于生物信息学分析和实验验证，但具体的分子机制仍需通过基因敲除模型或药物干预进一步验证。

此外，虽然本研究通过scRNA-seq揭示了巨噬细胞在PAH中的重要性，但其研究范围局限于肺组织。因此，未来的研究还应扩展至其他组织，如外周血或心脏组织，以全面评估这些生物标志物的表达和功能。最后，研究结果的临床转化仍需更多的验证，特别是这些标志物是否可以作为非侵入性检测手段，以及它们是否能够作为靶向治疗的潜在靶点。

### 总结

本研究通过整合多种技术手段，系统地揭示了自噬与PAH之间的关系，并识别出五个与巨噬细胞功能密切相关的生物标志物。这些发现不仅加深了对PAH发病机制的理解，还为未来的诊断和治疗策略提供了新的思路。然而，要实现这些标志物的临床应用，仍需进一步的研究，包括验证其在血液样本中的表达、探索其分子机制以及开发基于这些标志物的检测和治疗手段。未来的研究应重点关注这些方面，以推动PAH的精准医学发展。