揭示急性髓系白血病中常见体细胞变异导致的剪接异常

《Human Genomics》：Unveiling splicing disruptions due to common somatic variants in acute myeloid leukemia

急性髓系白血病（AML）的剪接调控变异研究。通过整合1540例AML患者的DNA和RNA测序数据，发现125个可能影响剪接的突变（13.7%），包括错义（61个）和 nonsense（23个）突变。实验验证17个突变，涉及EZH2、FLT3、ASXL1等基因，导致外显子跳过或激活cryptic剪接位点，影响蛋白结构和功能。提示剪接调控变异在AML发生中起重要作用，需结合多组学数据验证。

　　急性髓系白血病（AML）是一种复杂的血液恶性肿瘤，其特点是造血干细胞的克隆性异常扩增，导致未分化的髓系前体细胞大量积累。这种疾病在基因层面表现出高度的异质性，意味着不同患者的肿瘤可能由不同的基因突变驱动。尽管近年来通过基因组分析技术对AML的遗传学研究取得了显著进展，但与AML突变相关的剪接改变仍然未被充分探索。剪接是基因表达调控的重要环节，其异常可能对蛋白质功能产生深远影响，进而影响疾病的发生、发展、治疗反应和复发风险。因此，识别和理解这些剪接相关变异（Splicing-Associated Variants, SAVs）对于揭示AML的分子机制和寻找潜在治疗靶点具有重要意义。

本研究通过系统分析914个在1540名AML患者中发现的单核苷酸变异（SNVs），并结合来自BeatAML和TCGA-LAML队列的639例患者的DNA和RNA测序数据，识别出125个具有预测剪接影响的变异，分布在32个基因中。这些变异包括传统上被归类为错义或无义突变的类型。在对36个变异进行实验验证时，有17个变异通过RNA-seq和/或minigene实验被确认具有剪接影响。这些剪接改变主要表现为外显子跳跃或隐秘剪接位点的激活，尤其在与AML相关的基因如EZH2、FLT3、ASXL1、IDH1和U2AF1中更为常见。在某些情况下，这些剪接变化可能影响保守的蛋白质结构域，或通过无义介导的降解（NMD）机制导致mRNA的异常降解。这些发现揭示了剪接相关的变异在AML发病机制中的潜在作用，强调了整合预测与验证策略的重要性，以深入理解这些变异的功能及其在治疗中的意义。

为了全面评估这些变异对剪接的潜在影响，我们利用了MaxEntScan和SpliceAI这两种预测工具。MaxEntScan是一种基于最大熵模型的剪接位点预测工具，而SpliceAI则是基于深度学习的剪接预测方法。通过这些工具，我们能够识别出具有高剪接影响潜力的变异。我们设定了一些具体的阈值来筛选剪接相关变异，例如MaxEntScan评分高于3，且在野生型和突变型序列之间的变化超过10%，或者SpliceAI评分高于0.2。根据这些标准，我们筛选出125个可能影响剪接的变异，其中61个被归类为致癌性变异，64个为可能致癌性变异。这些变异主要分布在TET2、RAD21、PHF6、STAG2和DNMT3A等基因中，且其中大部分变异位于经典的剪接位点附近。

为了验证这些预测的剪接改变，我们采用了RNA-seq数据和minigene实验。通过RNA-seq数据，我们观察到一些变异在AML患者中显著改变了剪接模式，例如CBL c.1096–2 A > T和c.1096-1G > C变异激活了两个隐秘的剪接位点，而TET2 c.3954 + 5G > A变异则激活了一个隐秘的供体剪接位点。这些剪接改变在多个队列中被独立确认，表明它们在AML中的普遍性。此外，我们还发现一些变异虽然在RNA-seq中未达到显著性阈值，但在minigene实验中显示出剪接改变的迹象，如FLT3 p.N841K、KDM6A p.Q506*和WT1 p.S386*等。这些变异可能在低频率情况下产生显著的剪接效应，从而影响疾病进程。

通过minigene实验，我们进一步验证了这些变异对剪接的具体影响。其中，10个变异（占测试的16个变异中的63%）导致了异常的剪接事件，包括外显子跳跃和隐秘剪接位点的激活。例如，EZH2 p.M121I、TET2 p.R1167K和ASXL1 p.K85R等变异导致了相应的外显子4的完全跳跃，而FLT3 p.N841K和DNMT3A p.E817V则引发了外显子20的跳跃，尽管在这些变异中仍能检测到少量的正常转录本。这些实验结果表明，即使是一些传统上被归类为错义或无义的变异，也可能对剪接产生显著影响，从而改变蛋白质的功能。

我们还对这些剪接相关变异对蛋白质结构的潜在影响进行了分析。结果表明，一些变异可能导致蛋白质结构域的缺失或改变，从而影响其生物学功能。例如，IDH1 p.R132C/S变异不仅导致了异常的蛋白质编码，还激活了一个隐秘的供体剪接位点，这可能影响酶的催化效率。而U2AF1 p.Q157R变异则通过激活一个替代的5′供体剪接位点，导致第二CCCH锌指结构域内的一个在框内缺失，这种缺失可能影响蛋白质的锌结合能力，从而改变其对剪接的调控作用。这些结构域的改变可能进一步影响细胞的分化和增殖，从而对AML的临床表现和预后产生重要影响。

此外，我们还发现了一些变异可能通过剪接改变来影响疾病进程。例如，STAG2 p.L182*变异可能导致STAG2结构域的缺失，从而影响其与RAD21的相互作用，进而影响细胞分裂过程中的黏连蛋白功能。这些变化可能与基因组的不稳定性相关，进而导致肿瘤的形成和进展。同样，EZH2 p.M121I导致的外显子4跳跃可能影响EZH2的剪接异构体，从而改变其对基因表达的调控能力。

本研究的结果表明，剪接相关变异在AML中扮演着重要的角色，尽管它们在传统分析中常被忽视。这些变异可能通过改变剪接模式来影响蛋白质功能，从而在疾病的发生和进展中起到关键作用。因此，未来的研究应更加关注这些变异，尤其是在剪接分析中使用更敏感的阈值和多证据来源的整合方法。这不仅有助于更全面地理解AML的分子机制，还可能为新的治疗策略提供依据。通过深入研究这些变异，我们有望发现新的生物标志物，并开发更有效的靶向治疗方案，以改善AML患者的预后。