系统性炎症细胞因子与骨质疏松性病理骨折之间的因果关系：一项双向孟德尔随机化研究

《Medicine》：Causal effect between systemic inflammatory cytokines and osteoporotic pathological fractures: A bidirectional Mendelian randomization study

骨质疏松与炎症因子因果关系的双向孟德尔随机化分析揭示7种炎症因子（Artemin降低骨折风险，β-NGF、CXCL10等升高风险）与病理骨折存在直接因果关联，并发现骨折可反向影响CXCL11、IL-1α、TSLP等炎症因子水平。

　　骨质疏松是一种常见的代谢性骨疾病，其特征是骨密度降低和骨微结构破坏，从而显著增加骨折风险。全球范围内，骨质疏松每年导致超过890万例骨折，其中50岁以上的女性中约有三分之一会经历骨质疏松性骨折。男女性别比例约为1:1.6，女性在前臂、肱骨、髋部和脊柱骨折中占比分别为80%、75%、70%和58%。病理骨折不仅严重损害患者的生活质量，还显著提高死亡率，例如髋部骨折后一年内的死亡率可达20%至24%。骨质疏松及其并发症对医疗体系造成的经济负担也非常巨大，仅在美国，骨质疏松的直接医疗成本估计在137亿至203亿美元之间，预计到2025年将达到253亿美元。在欧洲，这一成本甚至更高，达到370亿欧元，其中超过70%与骨质疏松性骨折相关。此外，骨折后功能恢复通常不完全，不到一半的老年人能在一年内完全恢复行走能力和功能独立性，约40%至60%的人无法恢复到骨折前的健康状态。值得注意的是，首次发生骨质疏松性骨折后，再次骨折的风险在第一年内会增加2.7倍。随着人口老龄化趋势加剧，预计到2040年，65岁及以上人群的比例将从17.7%上升至24.2%，骨质疏松的疾病负担预计会进一步加重，因此需要更加有效的预防和治疗策略。

近年来，越来越多的证据表明，系统性炎症与骨代谢之间存在密切联系。炎症因子，包括肿瘤坏死因子（TNF）家族、白细胞介素（IL）家族、干扰素（IFN）和趋化因子等，被认为可能通过影响破骨细胞和成骨细胞的活性，参与骨质疏松的发生发展。例如，黄等人发现，血清中可溶性IL-6受体水平较高与股骨颈骨密度和骨强度下降显著相关。类似地，类风湿性关节炎患者的骨质疏松发病率是普通人群的2至3倍。然而，目前对这种关联的理解主要来自于观察性研究，这些研究在排除混杂因素和确立因果关系方面存在局限。因此，迫切需要更严谨的研究方法，如孟德尔随机化（MR）分析，以探索炎症因子与骨质疏松之间的潜在因果关系。尽管郑等研究分析了炎症因子与骨折在不同部位的相关性，但关于正常骨折与病理骨折之间差异的探讨仍存在空白，而病理骨折具有截然不同的临床治疗策略。因此，评估炎症在病理骨折中的因果作用具有重要意义。然而，目前仍缺乏针对其他炎症因子的大规模研究，这为未来研究提供了重要的方向。

为了克服传统观察性研究的局限性，本研究采用了双向MR方法，探讨系统性炎症因子与骨质疏松性病理骨折之间的因果关系。MR方法通过将遗传变异作为工具变量，模拟随机试验，从而有效控制混杂因素和反向因果关系。本研究的主要目标是确定特定炎症因子与病理骨折风险之间的因果关联，同时评估病理骨折是否会影响系统性炎症因子水平。通过这一双向分析，我们的研究首次系统地评估了这种关系的因果性和方向性，填补了现有研究的重要空白。

本研究利用了来自芬兰FinnGen生物库的大量基因组数据和基因组关联研究（GWAS）数据。FinnGen生物库包含了50万名芬兰生物库捐献者的基因组和健康数据，结合了国家健康登记的数字健康数据，为研究各种疾病，包括骨质疏松的遗传因素提供了全面的资源。GWAS数据来源于剑桥大学公共卫生与初级护理部的蛋白质研究部门，现在可在GWAS目录中访问（ID范围：GCST90274758至GCST90274848）。两个数据集均包括欧洲血统的个体，确保了遗传背景的一致性，为使用MR分析方法探讨炎症因子与骨质疏松之间的因果关系提供了可靠的基础。由于这些数据来自不同的队列，样本重叠预计较少，从而降低了偏倚的风险。然而，我们应用了敏感性分析，以进一步处理可能的重叠样本或人群分层带来的偏倚。

为了评估炎症因子与骨质疏松性病理骨折之间的因果关系，我们采用2样本MR分析方法。该方法基于三个关键假设：所选的工具变量（遗传变异）必须与血液中的炎症因子紧密相关；遗传变异必须独立于任何可能的混杂因素；并且遗传变异只能通过炎症因子影响骨质疏松性病理骨折，而没有其他直接的因果路径。我们从炎症因子的GWAS汇总数据中选择工具变量，使用显著性阈值P < 1×10??，以确保后续分析中具有足够的单核苷酸多态性（SNPs），特别是对于那些在基因组范围内仅有少数显著变异的细胞因子。尽管这种宽松的阈值可以提高统计功效，但我们意识到这可能增加假阳性关联或弱工具变量的风险。为了减轻这些风险，我们使用PLINK软件进行了严格的连锁不平衡（LD）修剪，设置物理距离阈值为10,000 kb，R2阈值为0.001，并对暴露和结果数据集应用相同的LD修剪程序，以排除可能高度相关的SNPs。此外，我们通过计算F统计量来评估每个工具变量的强度，排除F < 10的SNPs，以减少弱工具变量偏倚。这一步骤确保了所选的工具变量具有足够的统计功效来解释暴露变量的变化。通过这一系列严格的筛选过程，我们不仅提高了因果推断的可靠性，还帮助减少了潜在的偏倚和假阳性结果。补充文件1和表S1（补充数字内容）总结了每个炎症因子和骨折在应用GWAS显著性阈值、LD修剪和F统计量筛选后的保留SNPs数量。

为了全面评估血液炎症因子与骨质疏松性病理骨折之间的因果关系，我们使用了五种不同的MR方法：逆方差加权（IVW）、MR-Egger回归、加权中位数（WM）、简单模式和加权模式。每种方法都有其独特的优势和假设。IVW方法假设所有工具变量都是有效的，提供了最高的统计功效；MR-Egger回归可以检测并校正水平性多效性；WM方法即使在少数无效工具变量的情况下也能提供一致的估计；而模式方法在多数工具变量有效时表现良好。考虑到IVW方法在因果推断中的稳健性和广泛应用，我们选择它作为主要方法来估计因果效应，同时使用其他方法进行补充分析和结果验证。由于本研究分析了91种循环炎症因子，我们应用了严格的多重比较控制，使用Bonferroni校正，将显著性阈值调整为0.05除以91，以减少假阳性结果。只有通过这一校正阈值的结果才被视为统计学显著。

为了评估MR结果的稳健性和可靠性，我们进行了一系列敏感性分析。首先，我们使用了Leave-one-out交叉验证方法，通过排除单个SNP来评估其对总体因果效应估计的影响。这种方法有助于识别可能对结果产生过度影响的异常值。其次，我们采用了MR-PRESSO方法来检测和校正水平性多效性偏倚。MR-PRESSO通过识别并去除异常SNP来提高因果估计的准确性。此外，我们使用Cochran’s Q检验来评估因果效应估计的异质性，高异质性可能表明存在无效工具变量或效应修饰。最后，我们利用MR-Egger回归的截距项来测试方向性多效性偏倚，其中截距项显著偏离0可能表明存在系统性多效性。所有敏感性分析结果汇总在表3中，提供了对所有显著关联的全面总结。补充材料（补充数字内容）中提供了完整的敏感性分析细节。

在正向MR分析中，我们发现7种炎症因子与骨质疏松性病理骨折风险存在潜在的因果关联。其中，Artemin水平与骨折风险呈负相关（OR=0.7954，95% CI：0.6595–0.9593，P=0.0167），表明Artemin水平降低可能增加骨折风险。相反，6种其他炎症因子的水平升高似乎与骨折风险增加相关。具体而言，β-神经生长因子（β-NGF；OR=1.2375，95% CI：1.0100–1.5161，P=0.0398）、C-X-C趋化因子10（CXCL10；OR=1.2675，95% CI：1.0409–1.5435，P=0.0183）、C-X-C趋化因子6（CXCL6；OR=1.2623，95% CI：1.0848–1.4688，P=0.0026）、白细胞介素-10受体α亚基（IL-10Rα；OR=1.2828，95% CI：1.0393–1.5834，P=0.0204）、白细胞介素-10受体β亚基（IL-10Rβ；OR=1.1463，95% CI：1.0072–1.3047，P=0.0386）以及潜伏性相关肽转化生长因子β1（LAP-TGFβ1；OR=1.2481，95% CI：1.0346–1.5056，P=0.0206）均显示出与骨折风险增加的潜在因果关联。值得注意的是，CXCL6显示出最显著的相关性（P=0.0026），这可能表明其在骨质疏松发生中的重要作用。这些发现为我们理解炎症过程如何影响骨质疏松的发展提供了新的视角，同时也为潜在的治疗靶点提供了线索。

在反向MR分析中，我们发现骨质疏松性病理骨折可能影响4种循环炎症因子的水平。具体而言，骨折可能导致CXCL11、IL-1α和TSLP水平下降，以及TNF-β水平上升。这些结果揭示了骨折本身可能引起特定炎症因子水平的变化，强调了骨质疏松与炎症之间的双向关系。此外，在异质性、多效性和MR-PRESSO测试中，反向分析中发现的4种炎症因子与骨质疏松性病理骨折之间的关联未表现出显著的异质性或多效性，进一步支持了这些关联的稳健性。

在正向MR分析中发现的7种炎症因子中，Artemin和β-NGF作为神经营养因子，可能通过调节骨骼神经支配影响骨代谢。例如，一项关于绝经后早期骨质疏松患者的研究所显示，血清中β-NGF水平与骨密度呈负相关，而与骨折风险呈正相关。这表明β-NGF可能是骨质疏松进展的一个潜在生物标志物。有趣的是，它在年轻人的创伤性骨折中具有保护作用。CXCL10和CXCL6属于趋化因子家族，可能通过调节免疫细胞募集和骨细胞活性影响骨重塑过程。IL-10Rα和IL-10Rβ作为抗炎细胞因子IL-10的受体，可能通过调节炎症反应影响骨代谢。已有研究表明，IL-10基因多态性与绝经后女性的骨密度相关，提示IL-10信号通路在骨代谢中的重要性。LAP-TGFβ1是TGF-β1的潜伏形式，在骨重塑中发挥关键作用。与之前的研究相比，我们的MR分析不仅确认了某些已知的炎症因子（如CXCL10）与骨质疏松的关联，还发现了新的潜在靶点（如Artemin）。这些发现为骨质疏松的预防和治疗提供了新的方向。例如，针对这些炎症因子的靶向治疗可能成为未来骨质疏松治疗的新策略。此外，这些炎症因子的水平可用于开发新的风险评估工具，以帮助早期识别高风险人群。

本研究的反向MR分析揭示了骨折可能影响的4种炎症因子：CXCL11、IL-1α、TNF-β和TSLP。这些发现为我们理解骨折后的炎症反应及其对愈合过程的影响提供了新的视角。CXCL11作为一种趋化因子，在免疫细胞募集中起着重要作用。IL-1α是一种关键的促炎细胞因子，研究表明其在骨折早期水平升高，提示其可能在早期骨折修复中发挥重要作用。TNF-β（也称为淋巴毒素-α）在炎症和免疫反应中起重要作用。一项对47例骨折患者的研究发现，骨折后TNF-β水平显著升高。这种持续的炎症反应可能对骨折愈合过程产生复杂的影响。TSLP是一种与过敏和炎症相关的细胞因子，其水平变化可能显著影响骨折愈合和后续并发症。例如，CXCL11和IL-1α水平的适度升高可能有助于促进早期修复反应，但过度或持续的升高可能导致慢性炎症，影响愈合质量。

通过比较正向和反向MR结果，我们发现炎症与骨质疏松性病理骨折之间存在复杂的双向关系。正向MR结果表明，某些炎症因子（如CXCL10）可能增加骨折风险，而反向MR结果则显示骨折本身可能导致某些炎症因子水平的变化（如CXCL11）。这种复杂的相互作用突显了炎症在骨代谢和骨折修复中的核心作用。

本研究的发现对骨质疏松的预防、诊断、治疗和管理具有重要的临床和公共卫生意义。首先，在骨质疏松风险评估方面，我们发现的7种炎症因子（Artemin、β-NGF、CXCL10、CXCL6、IL-10Rα、IL-10Rβ和LAP-TGFβ1）可能成为新的生物标志物。将这些标志物整合到现有的风险评估工具（如FRAX模型）中，可以显著提高骨折风险预测的准确性。例如，一项基于基因组医学测序结果与FRAX模型结合的研究表明，将全基因组多基因风险评分纳入FRAX评估模型可以改善风险预测，净重新分类指数范围为0.024至0.072。这种改进有助于临床医生更早识别高风险人群，从而实施早期干预，减少骨折的发生率。在公共卫生政策制定方面，本研究的结果强调了炎症在骨骼健康中的重要性，为制定更全面的骨质疏松预防策略提供了依据。可以考虑在中老年人的常规健康检查中纳入炎症标志物的筛查。一项为期20年的纵向研究显示，炎症标志物如CXCL10和IL-10是特定的衰老因子，因此，对炎症因子的早期筛查可用于评估与病理骨折相关的年龄变化，从而提高生活质量调整年数。这种筛查策略可能成为未来骨质疏松和病理骨折预防的重要组成部分。

本研究通过创新的方法探索了循环炎症因子与骨质疏松性病理骨折之间的潜在因果关系，为该领域提供了重要的新见解。然而，在解释研究结果时仍需考虑一些局限性。首先，样本主要来自欧洲人群，这可能限制研究结果的普遍性，并引发关于人群分层的担忧。其次，尽管MR方法可以在一定程度上控制混杂因素，但其仍然依赖于关键假设，如工具变量的有效性和不存在水平性多效性。虽然进行了敏感性分析（如MR-Egger回归、WM等）以检测和校正多效性，但残留的不平衡多效性仍无法完全排除，这可能影响结果的可靠性。特别是对于某些具有较少全基因组显著SNPs的炎症因子，我们使用了较宽松的显著性阈值（P < 1×10??），这可能增加假阳性或弱工具变量偏倚的风险；然而，这种风险通过严格的LD修剪、排除F统计量小于10的SNPs以及多重敏感性分析得到了缓解。细胞因子定量中的测量误差可能会削弱因果估计，而反向MR分析可用的样本量有限可能降低检测反向因果关系的统计功效。此外，MR估计反映的是平均生命周期内的遗传效应，无法捕捉细胞因子水平与骨折风险之间的动态关系，可能掩盖重要的时间依赖性效应。尽管存在这些局限性，本研究仍展示了显著的创新性。双向MR设计不仅探讨了炎症因子对骨质疏松性病理骨折风险的影响，还评估了骨质疏松性病理骨折对炎症因子水平的潜在影响，为因果关系提供了更全面的视角。据我们所知，这是迄今为止对91种循环炎症因子与骨质疏松性病理骨折进行的大规模筛查，为系统理解炎症在骨质疏松性病理骨折中的作用奠定了基础。尽管观察到的比值比（OR）为1.09，表明个体风险的轻微增加，但由于骨质疏松在老年群体中的高发率，这种效应可能在公共卫生层面产生重大影响。

这些发现不仅在理论上加深了我们对炎症在骨质疏松发生中的作用的理解，特别是揭示了Artemin的保护作用，为骨代谢调节机制的研究提供了新的方向。在实际应用方面，研究结果为骨质疏松的风险评估、预防和治疗提供了新的见解。识别出的炎症因子可能成为新的生物标志物或治疗靶点，从而改善骨质疏松的临床管理策略。此外，研究结果还提示了未来研究的重要方向。首先，需要进行功能验证实验，包括体外和体内研究，以进一步验证和阐明发现的因果关系，特别是深入研究新发现的炎症因子（如Artemin）在骨代谢中的机制。其次，设计和开展针对本研究发现的新的风险评估工具或治疗策略的临床试验，例如评估将CXCL10和β-NGF纳入骨折风险评估模型的临床效果。此外，应在不同种族和地域人群中重复本研究，以验证结果的普遍性并探索可能的种族差异，这对全球骨质疏松预防和控制策略的制定具有重要意义。此外，开展长期的纵向研究，以探讨炎症因子水平与骨质疏松进展之间的动态关系，有助于更好地理解疾病的发展过程和机制。将本研究的结果与其他组学数据（如转录组学、蛋白质组学）结合，预计能提供更全面的骨质疏松分子机制图景。基于本研究发现的炎症因子筛选现有的药物库，以寻找骨质疏松预防或治疗的潜在候选药物，这种药物重新定位策略可能加速新治疗方法的开发。最后，利用机器学习算法将本研究发现的炎症标志物与其他临床和影像特征相结合，以开发更精确的骨折风险预测模型，这可能显著提高骨质疏松的早期诊断和个性化管理能力。

综上所述，本研究采用双向2样本MR方法系统地探讨了91种循环炎症因子与骨质疏松性病理骨折之间的潜在因果关系，揭示了一系列重要的发现。我们确定了7种与骨质疏松性病理骨折风险显著相关的炎症因子。其中，Artemin表现出保护作用，而β-NGF、CXCL10、CXCL6、IL-10Rα、IL-10Rβ和LAP-TGFβ1的水平升高与骨质疏松性病理骨折风险增加相关。反向分析结果进一步支持了这些炎症因子对骨折风险的单向因果影响，同时也揭示了骨折本身可能影响某些炎症因子的水平。具体而言，骨折可能导致CXCL11、IL-1α和TSLP水平下降，以及TNF-β水平上升。这些关联在异质性、多效性和MR-PRESSO测试中表现出良好的稳健性，支持其作为因果因子的潜力。这些研究成果突显了骨质疏松性病理骨折与炎症之间复杂的双向关系。