综述：高致病性禽流感A型病毒的侧向流动装置与即时检测新进展

《Journal of Virology》：Recent advances in lateral flow devices and point-of-care diagnostics for highly pathogenic avian influenza A viruses

本综述系统回顾了2024年禽流感再度暴发背景下的快速检测技术进展，重点介绍了侧向流动分析技术（LFA）及其与CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）系统结合的最新应用。文章指出，传统方法如病毒分离和逆转录定量PCR（qRT-PCR）虽可靠但耗时，而LFA和CRISPR-Cas（CRISPR相关蛋白）技术为高致病性禽流感（HPAI）病毒（如H5N1、H7N9）的现场快速、高灵敏度检测提供了新策略，尤其在资源有限地区和大规模筛查中潜力巨大。

　　

ABSTRACT

自2024年初以来，禽流感出现再度暴发和持续流行。由A型流感病毒引起的禽流感因其人畜共患潜力，对禽类种群和公共卫生构成重大威胁。高致病性禽流感（HPAI）病毒，如H5N1和H7亚型，具有高死亡率。传统的检测方法，即病毒分离和逆转录定量PCR（qRT-PCR），诊断可靠但耗时耗力。快速、准确地检测禽流感A型病毒对于防止大规模暴发和减少经济损失至关重要。现场就绪和即时（POC）诊断技术，如侧向流动分析（LFA），为检测禽流感A型病毒感染提供了一种快速、早期且大规模的方法。在高致病性禽流感管理中，早期检测是提高治疗效果和减少对动物健康负面影响的关键因素。这篇微型综述介绍了当前现场就绪和POC诊断技术的原理和方法，重点阐述了用于高致病性禽流感检测的LFA。它还概述并比较了其发展、应用和市场可用性。值得注意的是，诸如LFA与成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）整合等先进技术已经扩展了高致病性禽流感的诊断能力，并也已被评述。基于CRISPR的LFA使用向导RNA检测病毒序列，激活Cas酶，在测试条上产生可见信号，从而实现一种快速、灵敏的检测方法。据我们所知，这是第一篇在2024年禽流感再度暴发背景下总结基于LFA的高致病性禽流感诊断技术的全面综述，为理解其在疫情准备和应对中的潜在作用提供了及时的见解。

INTRODUCTION

禽流感，俗称禽流感，是一种影响全球鸟类的传染性病毒性疾病。由A型流感病毒引起，禽流感因其人畜共患传播潜力而对禽类种群和公共卫生构成重大威胁。特别是高致病性禽流感（HPAI），如H5N1和H7亚型病毒，表现出高死亡率。快速、准确地检测禽流感病毒（AIVs）对于实施控制措施、防止大规模暴发和最大限度地减少家禽业的经济损失至关重要。

H5N1于1996年首次在中国广东的鹅中检测到。首例人类H5N1病例于1997年在香港被描述。近年来，全球禽流感形势经历了一系列显著的暴发。2021年5月，在野生鸟类高致病性禽流感暴发期间，荷兰一家康复中心的野生狐狸中检测到高致病性禽流感H5N1病毒。从2021年底到2022年，根据世界动物卫生组织的说法，引起全球家禽暴发的主要高致病性禽流感H5病毒是野生鸟类适应的H5N1病毒。2022年，高致病性禽流感H5N1在商业家禽中重新出现，美国火鸡暴发疫情，西班牙报告了两名暴露于感染鸡群的禽类工人中的无症状人类病例，这标志着自2020年以来美国首次检测到该病毒，并引发了对人畜共患传播的担忧。

早期检测对于有效的疾病管理至关重要，能够实现及时的控制措施并减少对动物健康的影响。最近的事件凸显了高致病性禽流感病毒（HPAIVs）的不断演变，并强化了对强大监测系统和可靠诊断工具的迫切需求。高致病性禽流感病毒的传统诊断方法，如病毒分离和逆转录PCR（RT-PCR），具有高灵敏度和特异性。然而，它们需要专门的实验室设施和训练有素的人员，耗时且可能延误疫情应对工作。相比之下，侧向流动分析（LFA）为高致病性禽流感病毒的现场检测提供了一种快速、用户友好且成本效益高的替代方案。LFA旨在检测样品中的特定抗原或抗体，无需复杂设备即可在几分钟内提供结果。

LFA在禽流感检测中的应用势头强劲，特别是在资源有限的环境和现场调查中。其便携性和易用性使其对于即时决策和实施控制措施具有无可估量的价值。此外，LFA技术的进步带来了灵敏度和特异性的提高，增强了其作为诊断工具的可靠性。

本综述全面概述了LFA在禽流感检测中的应用，重点关注高致病性禽流感毒株。鉴于自2024年初以来再度暴发和持续流行的疫情，影响了家禽、奶牛甚至导致人畜共患感染，迫切需要快速、易用的诊断技术来补充传统的实验室方法，如病毒分离和逆转录定量PCR（qRT-PCR）。LFA在早期检测、大规模筛查和疫情期间现场决策方面具有实际优势。据我们所知，这是在2024年疫情背景下进行的首篇关于基于LFA的高致病性禽流感诊断技术的全面综述。随着高致病性禽流感持续威胁动物和人类健康，将LFA等快速诊断工具整合到监测计划中对于减轻未来疫情的影响至关重要。

ZOONOTIC HIGHLY PATHOGENIC AVIAN INFLUENZA A VIRUSES AND THE TROPISM

A型流感病毒属于正粘病毒科，具有八个节段的负链RNA基因组。该病毒包含八个编码必需蛋白的基因片段，包括血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA），它们决定了病毒亚型和宿主特异性。分段基因组允许重配，促进了具有人畜共患和大流行潜力的新毒株的出现。

A型流感病毒根据病毒的两种表面蛋白——HA和NA分为亚型。目前已知有18种HA亚型和11种NA亚型。多种AIVs亚型与人畜共患传播相关，导致散发性人类感染并构成大流行威胁。这些病毒主要在鸟类中传播，但已证明能够感染人类，有时导致严重的疾病暴发。持续的监测和研究对于理解其进化、传播和对公共健康的潜在影响至关重要。

H5N1 viruses

高致病性禽流感H5N1自1997年在香港出现以来，已在家禽中引起严重暴发和散发性人类病例。该病毒在人类中表现出高病死率，通常超过50%，使其成为公共卫生的重要关注点。传播主要通过直接接触受感染鸟类或污染环境发生，迄今为止尚未报告持续的人际传播。然而，该病毒通过基因重配和突变不断进化，引发了对其大流行潜力的担忧。

H5N1已传播到多个大洲，影响家禽养殖场、野生鸟类，偶尔也影响哺乳动物。已鉴定出H5N1的多个进化枝和亚进化枝，每个都具有不同水平的毒力和传播力。H5N1主要感染鸟类的呼吸道和胃肠道，引起严重的全身性感染。在人类中，H5N1优先结合存在于下呼吸道的α2,3-连接唾液酸受体，导致严重肺炎、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和多器官衰竭。该病毒已从大脑、肠道和其他器官中分离出来，表明具有神经嗜性和全身性传播。其感染哺乳动物（包括人类）的能力引发了对人畜共患溢出和大流行潜力的担忧。

控制H5N1的努力包括家禽疫苗接种计划、扑杀感染群和严格的生物安全措施。此外，奥司他韦等抗病毒治疗已用于感染者，但耐药性仍然是一个问题。鉴于其持续进化，持续的监测和研究对于减轻与H5N1相关的风险至关重要。

H7N9 viruses

H7N9是一种禽流感病毒，于2013年在中国人类中出现，引起严重呼吸道疾病和高死亡率。H7N9被归类为鸟类中的低致病性禽流感病毒（LPAIV），意味着受感染的家禽可能几乎不显示或完全不显示症状。然而，2017年3月，美国农业部（USDA）确认在美国一个肉鸡种鸡群中存在高致病性禽流感H7N9。此外，当传播给人类时，该病毒可引起严重肺炎、ARDS和多器官衰竭。H7N9的病例死亡率因暴发浪潮而异，一些感染浪潮的死亡率超过30%。

H7N9主要感染禽类的呼吸道和胃肠道。在人类中，H7N9表现出对α2,3-连接唾液酸受体的偏好，主要存在于下呼吸道，导致严重肺炎和ARDS。该病毒已显示出有限的全身性传播证据，在血液和其他器官中检测到。其结合禽类和人类受体的能力表明存在适应和潜在人际传播的风险。

遗传学研究揭示，H7N9具有增强其与人类呼吸道受体结合亲和力的突变，增加了对其大流行潜力的担忧。已在家禽中实施疫苗接种工作以减少病毒传播，而NA抑制剂等抗病毒治疗仍然是感染个体的主要治疗选择。持续监测和研究对于防止进一步的人畜共患溢出和潜在的人际传播适应至关重要。

Other subtypes

H1N1也以其人畜共患和重配潜力而闻名，感染人类和动物。2009年的大流行凸显了其适应性，强调了疫苗接种、生物安全和持续监测以防止暴发的必要性。H1N1主要靶向呼吸道上皮，结合α2,3-和α2,6-连接唾液酸受体，促进种间传播。在猪中，H1N1在肠道中有效复制，实现粪口传播。在人类中，它感染上呼吸道，导致轻度至重度呼吸道疾病。

H9N2是一种在全世界家禽中传播的低致病性禽流感病毒。在家禽中，H9N2主要在呼吸道和胃肠道复制，引起轻度至中度疾病。人类感染通常轻微，由于其对α2,3-和α2,6-连接唾液酸受体的亲和力，在上呼吸道观察到病毒复制。虽然它主要影响鸟类，但已报告散发性人类感染，特别是在职业暴露于受感染家禽的个体中。H9N2人类感染通常导致轻度呼吸道症状，但其重要性在于其作为其他人畜共患流感病毒遗传供体的作用。H9N2病毒通过基因重配参与高致病性毒株（如H5N1和H7N9）的进化。该病毒拥有的内部基因片段有助于出现具有增加人类感染性的新型流感毒株。

虽然H5、H7和H9禽流感A型病毒最常与人类感染相关，但其他亚型也构成人畜共患风险。历史例子包括1957年H2N2亚洲流感、1968年H3N2香港流感和1977年俄罗斯流感。最近，2015年在美国猪中检测到禽源性H4N6病毒，并且报告了儿童中的H5N6感染。这些病毒重配的能力凸显了持续监测的必要性。此外，一些H10N4和H10N8病毒已证明能够结合人类样受体。H11N9病毒可以直接从鸭子传播给猎人。这些禽流感亚型主要在鸟类中传播，但人类通过接触受感染鸟类或污染环境发生感染。大多数AIVs表现出对α2,3-连接受体的强亲和力，限制了人际传播但构成人畜共患威胁。这些亚型多样的宿主嗜性强调了种间传播和潜在大流行的持续风险。

因此，全球监测、强有力的生物安全措施和有效的疫苗接种策略对于最大限度地减少人畜共患风险至关重要。更深入地了解这些病毒的遗传和流行病学特征对于预测和准备未来的暴发至关重要。

FIELD-READY AND POINT-OF-CARE (POC) TESTING FOR HPAI

禽流感从低致病性毒株进展为家禽中的高致病性毒株最早于1996年在国内鹅中有记录，而H5N1亚型的高致病性禽流感病毒在各种动物物种中的出现构成了潜在的大流行风险。虽然qRT-PCR结合旋转柱RNA提取仍然是高致病性禽流感病毒监测的金标准，但其他流感病毒检测和诊断测试方法，如（1）抗原快速检测，（2）病毒RNA快速分子检测，（3）免疫荧光检测，（4）病毒培养，和（5）血清学检测也可以实施。随着现场检测需求的增长，即时检测（POC）已成为传统方法的可行替代方案，主要由于其快速结果、易用性、可负担性和最低的基础设施要求。POC测试设备的主要类型之一是纸基技术。纸基设备更适合更简单、通常是单步的反应，并且成本更低，这使其在资源有限的地区得到广泛应用。在不同的纸基POC选项——试纸条、LFA和微流控设备中，LFA因其易于生产、操作简单、坚固性和用户友好性而脱颖而出。侧向流动分析利用毛细作用结合结合或捕获元件，以试纸条形式检测目标分析物。由于其已证明的优势，LFA引起了研究人员、发明家和医疗保健专业人员的极大兴趣，将其应用扩展到各个POC领域。

最近的研究强调了成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统，即CRISPR序列和相关核酸酶系统，作为POC测试先进平台的潜力。这些系统已应用于检测广泛的目标，包括病毒、细菌、寄生虫、癌症突变、基因型和小分子，将CRISPR技术置于下一代诊断的前沿。特别是，基于免疫的方法和基于CRISPR-Cas13a的检测技术在高致病性禽流感方面引起了显著关注。基于CRISPR的方法已在实验室规模成功集成到LFA系统中，展示了在高致病性禽流感暴发情景下进行早期检测的强大潜力。

Antibody-based LFAs for HPAI

基于免疫的血清学测试，如酶联免疫吸附测定（ELISA），可以检测引发的抗体，这是宿主对感染免疫反应的直接结果。免疫球蛋白G（IgG）ELISA已被用于测量抗体与各种季节性和禽类HA蛋白的识别和结合。然而，这些测试可能不可靠，特别是在感染早期阶段，因为其检测限。另一方面，通过ELISA对高致病性禽流感病毒的HA和NA蛋白进行抗原检测可用于暴发初始阶段，但需要专用设备、试剂和技术专业知识。

快速和精确的诊断是控制高致病性禽流感病毒的关键方法之一，但由于高致病性禽流感病毒进化过程中广泛的抗原变异，高致病性禽流感诊断工具的灵敏度随时间逐渐降低。为了克服这一点，Nguyen, Nakaishi等人设计了一种快速LFA检测试剂盒，通过结合两种抗H5 HA单克隆抗体（mAbs），（1）来自Linjudge Flu A/H5的A64/和（2）新型mAb A32/2，该抗体由进化枝2.3.4.4 H5高致病性禽流感产生。这种新方法提高了原始Linjudge Flu A/H5的灵敏度和特异性，如其成功检测来自遗传进化枝2.3.4.4的H5N6高致病性禽流感病毒自然和实验感染鸟类的拭子和组织匀浆抗原所证明（10^2.2–10^3.4 TCID₅₀/test）。当测试一组18个IAV参考毒株（H1–H16亚型）和两个流感B病毒毒株时，未观察到交叉反应性。最近，Mata Calidonio, Maddox等人设计了一种低成本纸基免疫分析，可以从更广泛的高致病性禽流感相关样品基质中检测H5N1 HA蛋白，例如来自人类、绵羊、马、家禽的血清，乳制品（鸡蛋和牛奶）和野生鸟类（口腔、泄殖腔和粪便样品）。该研究还包括一个属于高致病性禽流感H5进化枝2.3.4的毒株，该毒株仍具有与后代进化枝2.3.4.4相似的抗原特性，并占当前疫情的大部分病例。用α-HA IgG抗体功能化的金纳米球建立了直接的比色响应，在人类血清和全脂牛奶中的检测限（LOD）分别为0.16 nM和1.72 nM。然而，当测试高粘度基质（高脂奶油）时，免疫分析表现相对不佳。

高致病性禽流感病毒的内部核蛋白（NP）也成为诊断开发的目标，因为它在AIVs中高度保守，与HA和NA蛋白相比突变敏感性较低。Lee, Kim等人设计了一种具有信号放大能力的多孔二氧化硅纳米粒子基化学发光LFA系统，用于检测高致病性禽流感（H5N9）的NP。该LFA系统能够从鸡的泄殖腔和口咽拭子样品中检测比商业快速试剂盒/方法低20至100倍的AIV水平，检测限（LOD）为10⁴（50% egg infective dose; EID₅₀）/mL。其信号可放大的传感探针依赖于二氧化硅纳米粒子的最佳孔径，例如大的空腔，其中较大的生物分子，如抗体，被连接在外壁上，增加了与高致病性禽流感NPs结合的机会。然而，由于NP集中在高致病性禽流感病毒的包膜内，需要额外的裂解步骤以促进其释放。

有市售的基于免疫的LFA系统，专门用于定性检测H5N1抗原，例如用于家禽气管或泄殖腔分泌物的禽流感病毒H5N1抗原侧向流动分析试剂盒（Elabscience, Houston, TX, USA）。另一种金免疫层析分析，禽流感H5N1病毒快速测试试剂盒（Abbexa, Cambridge, UK），也可以定性检测鸡的粪便和唾液中的H5N1抗原。感染H5N1的奶牛通常表现出临床症状，如呼吸窘迫、食欲下降、粪便稠度改变、产奶量减少和异常。可以使用AIV-H5N1抗原快速测试试剂盒（Reagen, San Diego, CA, USA）检测牛奶样品中的H5N1抗原，辅助感染诊断。此外，美国农业部（USDA）批准了一种商业产品FluDETECT Avian（Zoetis, Parsippany, NJ, USA），用于鸡和火鸡。这些传统的商业基于免疫的LFA系统在目标抗原丰度超过LOD时产生线信号。然而，样品基质成分（如蛋白质和盐）可能粘附到硝酸纤维素膜或抗体上，导致非特异性结合。此外，粪便和组织裂解物可能堵塞膜并造成流动不均匀，导致假象形成。

CRISPR-based LFA for avian influenza

CRISPR系统是一种强大的基因编辑技术，源自细菌免疫防御机制，它使用RNA引导的酶，即Cas蛋白，来精确识别和切割特定的DNA或RNA序列。当与LFA集成时，基于CRISPR的平台使用向导RNA识别病毒或细菌序列，激活Cas酶，在测试条上产生可检测的信号。这种结合允许在护理点快速、灵敏、便携地检测病原体，以分子水平的精度增强了传统LFA的能力。检测来自各种环境来源（例如水、粪便等）的DNA和RNA是监测潜在野生动物病原体的一种有前途的方法，对生物或其栖息地的干扰有限。微创方法（如擦拭或刷洗动物）和非侵入性方法（如环境DNA采样）在调查各种物种方面显示出巨大潜力，包括隐藏的入侵物种和濒危物种。基于CRISPR的诊断是强大的工具，可以成功检测来自相关目标病原体的独特DNA和RNA序列；然而，其在野生动物疾病管理中的应用进展缓慢。LFA已被研究作为将CRISPR-Cas13a技术集成到现场就绪/POC诊断中的兼容平台，并将其结果转换为可见且易于解释的信号。

Li等人设计了一种重组酶辅助扩增（RAA）结合CRISPR-Cas13a和LFA系统，用于从临床样品中检测H5禽流感病毒。该方法达到了0.1 copy/μL的LOD，与qRT-PCR一致。未观察到与其他AIVs（H3, H7, H9, H10）的交叉反应性。类似地，Yang, Yang等人开发了两种基于CRISPR-Cas13a的禽流感病毒快速检测方法。这些方法通过M基因检测禽流感病毒，并通过HA基因鉴定H5、H7和H9亚型。第一种使用逆转录（RT）-RAA与Cas13a进行扩增和qRT-PCR，达到1 copy/μL的LOD。第二种技术结合了逆转录重组酶辅助扩增（RT-RAA）与Cas13a和LFA系统，达到10 copies/μL的LOD。两种方法都显示出高灵敏度和特异性，有可能超过qRT-PCR用于临床。Zhang, Wang等人实施了非常相似的方法，该方法测试了额外的非目标，如传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒和新城疫病毒，其中未报告交叉反应性。此外，还使用RT-RAA-LF试纸条测试了来自表现出与禽流感感染相关的轻度或重度呼吸道症状的个体鸡的临床样品（例如喉拭子）中的禽流感病毒H5、H7和H9。它们显示出10¹ copies/μL的LOD – 与实时荧光qRT-PCR的结果一致，但该方法是在排除CRISPR-Cas13a方法的情况下采用的。

对于免离心的H5Nx禽流感检测方法，Song等人将使用抗NP抗体的磁珠基RNP纯化与由DMSO介导的扩增子变性实现的PAM（前间区序列邻近基序）非依赖性CRISPR-Cas12a系统相结合。这消除了旋转柱和特定PAM序列的需求，增加了灵活性。该检测以高特异性检测H5Nx，达到10¹ EID₅₀（荧光）和10² EID₅₀（侧向流动）的灵敏度，临床样品灵敏度为80%，特异性为100%。这种方法为快速突变的RNA病毒提供了一种有前途的现场诊断工具。

核酸的预扩增方法（例如RAA）提高了CRISPR-Cas的整体灵敏度，即使存在PCR干扰物。通过将CRISPR精确靶向特定核酸的能力与LFA的用户友好性和速度相结合，所得平台为高致病性禽流感和各种致病病毒因子提供了准确、快速、成本效益高且便携的测试。它们的结合在速度、灵敏度和可及性方面表现出色，并且高度适应于现场就绪和即时诊断。

虽然用于高致病性禽流感的基于CRISPR的LFA尚未在市场上商业化，但积极的研究调查目前正在探索这项技术，可能只是时间问题，这些高灵敏度和快速的测试将被部署用于检测高致病性禽流感。

CHALLENGES AND LIMITATIONS OF LFA-BASED TECHNOLOGY FOR AVIAN INFLUENZA DETECTION

基于LFA的技术因其快速结果、易用性和成本效益而被广泛用于病毒检测。然而，一些挑战和限制阻碍了其在疾病监测和疫情控制中的更广泛应用。传统基于抗体的LFA的一个主要关注点是其灵敏度和特异性不