《Talanta》：Enhanced selectivity and sensitivity of sequential injection chromatography: determination of bioflavonoids in nutraceuticals
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二氢黄酮醇类物质在SIC中的高灵敏度分离与自动化分析优化，采用5μm多孔层颗粒柱和乙腈-0.01mol/L磷酸水（pH2.0）25:75等度洗脱，结合90%流细胞体积缩减和20Hz高频率光谱采集，通过Savitzky-Golay滤波实现信噪比提升，检测限达0.6mg/L，10分钟内完成分析且RSD≤2.31%。
Petr Chocholou?|Kristyna Pavelková|Ond?ej Vaněk|Matej Gu?iňák|Petr Solich|Dalibor ?atínsky
查尔斯大学药学院分析化学系，赫拉德茨-克拉洛韦市，Akademika Heyrovského 1203/8，500 05，捷克共和国
摘要
顺序注射色谱法（SIC）的逐步发展旨在提高分离的选择性和灵敏度。在本研究中，使用HPLC柱、小于2 μL的流动池检测器以及对UV-Vis光谱数据的先进处理方法，来测定营养保健品中密切相关的分析物（如迪奥斯明和 hesperidin）的浓度。这些改进使得色谱峰更窄、分辨率更高，并通过Savitzky-Golay滤波器获得了更多的原始数据，从而有效降低了噪声。随后自动计算了色谱峰的特征，这有助于方法开发和样品分析过程中的数据评估。所开发的SIC方法采用了标准的100 × 4.6 mm、5 μm多层颗粒填充柱，以乙腈和0.01 mol L-1磷酸水溶液（pH 2.0）的混合物（体积比25:75）作为流动相，并在200-350 nm范围内进行分光光度检测，分辨率为1 nm。对5 μL样品的分析结果显示：迪奥斯明的检测限（LOD）为0.6 mg L-1，定量限（LOQ）为2.0 mg L-1，线性范围为2.0–250.0 mg L-1（r>0.999）；hesperidin和rutin的线性范围也为2.0–150.0 mg L-1（r>0.999），并且在10 mg L-1浓度下峰面积的重现性良好（RSD ≤2.31%）。色谱过程的性能通过HETP值≤25 μm、峰对称度≤1.26、分辨率≥2.21以及每次分析所需时间8.0分钟得到了充分证明。该研究证明了SIC在解决复杂色谱问题方面的能力和适用性得到了提升。
引言
顺序注射色谱法于2003年作为HPLC的替代分析工具被提出[1]。它结合了多功能流动装置和单体色谱柱。其发展重点是通过使用更长的单体柱和颗粒填充柱来提高方法的选择性和灵敏度，逐渐接近标准HPLC柱[2]、[3]；在SIC系统中直接集成在线SPE步骤[4]、[5]；引入创新的二维色谱分离模式[6]或二维色谱技术[7]。为了满足液相色谱及其所用柱子的要求，SIC系统在化学耐受性和压力耐受性方面得到了改进，泵的功率也得到了增强，能够承受高达1,500 psi / 10 MPa的压力[5]。这些改进使得分离出的色谱峰更窄、更高。然而，由于传统检测软件在数据采集速率方面的限制以及无法在传统仪器软件中进行运行后数据处理和评估，检测效果仍存在不足。最新版本的SIC软件可以从CCD检测器以20 Hz的速率获取完整的UV-Vis光谱数据，这有助于提高分析物鉴定的选择性、精确设置基线并降低信号噪声。最后两个方面可以在不更新硬件的情况下扩展方法的线性范围，因为信噪比是决定方法检测限（LOD）的关键因素。
本研究致力于寻找一种灵敏度高且选择性强 的方法，重点在于提高对测量数据的处理和评估效率。通过简化检测器设计（将检测器流动池的内体积减少了90%），改进了检测器设置[8]。这一改进在分离三种生物类黄酮时得到了验证：其中两种生物类黄酮具有相似的化学结构，但样品含量差异较大（9:1 w/w）。为了提高方法的选择性，首次在SIC中使用了10 cm长的颗粒填充HPLC柱，仅需对软件进行简单调整。
生物类黄酮因其抗氧化特性而受到广泛关注，常用于辅助治疗生活方式相关疾病[9]、[10]。Diosmin（diosmetin 7-O-rutinoside）和hesperidin（hesperetin 7-O-rutinoside）是柑橘类水果皮中的主要次生代谢物，具有促进血液循环的作用，常用于口服营养补充剂和注册药物中，用于治疗痔疮和慢性静脉功能不全[11]。Diosmin和hesperidin是一对氧化还原物质，仅分子量相差两个氢原子。商业上，Diosmin通常通过氧化hesperidin制备，这一过程产生的混合物中这两种物质的占比约为9:1（w/w）[12]。多项研究表明，在食品、营养补充剂和注册药物中测定黄酮类化合物（包括diosmin和hesperidin）时，需要高方法选择性和宽检测范围[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]。
方法细节
化学试剂
乙腈（>99.9% LC/MS级）和甲醇（LC/MS级）购自Merck（捷克）；85% p.a.的磷酸购自Penta（捷克）；≥99.7%的二甲基亚砜（DMSO）购自Supelco（捷克）；Diosmin（diosmetin 7-O-rutinoside，CAS 520-27-4）的纯度≥95%购自Sigma-Aldrich（捷克）；hesperidin（hesperetin 7-O-rutinoside，CAS 520-26-3）的纯度≥90%购自Fluka（捷克）；rutin（quercetin 3-O-rutinoside，CAS 153-18-4）的纯度≥94%也购自Sigma-Aldrich（捷克）。超纯水由...顺序注射色谱法的发展
该方法的目标是在最短时间内分离目标分析物。SIC的开发始于使用Phenomenex Kinetex? EVO C18（50×4.6 mm，5 μm，表面多孔颗粒填充柱），在等度条件下以20-30%的乙腈或甲醇及稀释后的磷酸作为流动相。流动相的组成仅影响分析物的保留时间，但迪奥斯明和hesperidin这对分析物的分离效果尚不理想。
结论
首次使用经典颗粒填充HPLC柱后，SIC的整体分离性能得到了提升：检测器流动池的空隙体积显著减小，光谱数据采集速度加快，运行后的数据处理也更加先进。更新后的检测器设置和有效的噪声降低措施提高了方法的选择性、检测限，并扩展了线性范围。色谱图的自动化评估促进了方法的发展。
CRediT作者贡献声明
Dalibor ?atínsky：撰写、审稿与编辑、项目管理、资金筹集。Petr Solich：项目管理、资金筹集、概念构思。Matej Gu?iňák：实验研究、数据分析、数据管理。Ond?ej Vaněk：验证实验、数据分析、数据管理。Kristyna Pavelková：验证实验、数据分析。Petr Chocholou?：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、项目管理、方法设计、实验研究。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究工作的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢SVV项目编号260 662的财政支持。同时，作者感谢Jaromir Ruzicka在色谱流控编程和检测器升级方面提供的宝贵建议和讨论。
