MSC膜包覆的circPROSC-siRNA纳米颗粒通过抑制颅缝过早骨化来改善颅缝早闭

《Advanced Science》：MSC Membrane-Coated circPROSC-siRNA Nanoparticles for Ameliorating Craniosynostosis by Inhibiting Premature Suture Ossification

circPROSC作为环状RNA被鉴定为颅缝早闭的独立风险因素，通过miR-6815-5p/Wnt/β-catenin信号通路促进间充质干细胞成骨分化。开发MSC膜修饰的siRNA纳米颗粒（MM@Lipo/siRNA）靶向抑制circPROSC表达，有效缓解小鼠模型中早发性颅缝闭合。该研究首次证实circPROSC作为诊断标志物和治疗靶点的潜力，并提供了微创治疗新策略。

　　颅骨缝合过早（Craniosynostosis）是一种常见的先天性颅面发育障碍，其特征是婴儿颅骨缝合提前闭合，导致头颅形状异常和一系列严重的临床表现，如颅内压升高、脑部发育受限以及神经系统功能障碍。尽管已有研究表明多种基因，如TWIST1/2、FGFR1/2/3和MSX2等，在颅骨缝合过早的发病机制中扮演重要角色，但仍有约70%的患者无法找到明确的致病基因突变。这表明，除了遗传因素外，表观遗传调控在疾病的发生过程中也起着关键作用。近年来，表观遗传调控的研究逐渐成为理解颅骨缝合过早发病机制的重要方向，然而其具体的调控机制仍不明确。

本研究首次发现了循环RNA（circRNA）circPROSC作为颅骨缝合过早的独立风险因子。通过体外MSCs成骨分化实验和裸鼠异位骨形成实验，研究证实circPROSC能够通过miR-6815-5p调控Wnt信号通路，从而促进成骨过程。进一步，研究团队开发了一种新型的MSC膜包被的siRNA纳米颗粒（MM@Lipo/siRNA），其可靶向circPROSC，通过产后颅骨微注射的方式，有效抑制了颅骨缝合过早小鼠模型中冠状缝合的过早闭合。这些发现不仅揭示了circPROSC在颅骨缝合过早中的重要作用，也为该疾病的早期诊断和微创治疗提供了新的思路。

circRNA是一类具有高稳定性和组织特异性的非编码RNA，其在多种疾病中的诊断和治疗潜力日益受到关注。已有研究表明，某些circRNA在骨代谢相关疾病中发挥关键作用，如骨质疏松症、骨关节炎和椎间盘退化等。例如，circSTX12通过竞争性结合E3泛素连接酶CBL，抑制成骨过程，从而导致骨质疏松症的发生；circRNA.33186通过与miR-127-5p结合，抑制其活性，进而增加MMP-13的表达，参与骨关节炎的病理过程；而circSMAD4则通过导致Yap1 mRNA降解，促进软骨终板骨化，从而引发椎间盘退化。这些发现提示，circRNA可能在骨骼发育和相关疾病中具有重要的调控功能。

尽管circRNA在骨骼疾病中的作用已被广泛研究，但其在颅骨缝合过早中的具体机制尚未完全阐明。本研究通过circRNA微阵列分析和RT-qPCR验证，发现circPROSC在颅骨缝合过早患者的颅骨缝合组织中显著上调，并且在hMSCs成骨分化过程中也呈现逐步增加的趋势。进一步的生物信息学分析和荧光原位杂交（FISH）实验表明，circPROSC主要定位于细胞质中，并且具有抵抗RNase R降解的能力，这表明其结构稳定性较高。此外，circPROSC的表达水平与成骨相关标志物（如RUNX2、OPN和COL1A1）呈正相关，且其在血浆中的表达水平与颅骨缝合过早的发生风险显著相关，提示其可能作为有效的生物标志物。

为了进一步探究circPROSC对hMSCs成骨能力的影响，研究团队通过过表达和敲低circPROSC，观察其对成骨相关指标的影响。实验结果显示，circPROSC的过表达显著增强了hMSCs的成骨能力，包括碱性磷酸酶（ALP）活性、矿化能力以及成骨相关蛋白的表达，而其敲低则表现出相反的效果。在体内实验中，将circPROSC过表达的hMSCs与β-TCP复合物一起移植到裸鼠体内，发现其促进了骨样结构的形成和胶原沉积，而circPROSC的敲低则显著抑制了这些成骨现象。这些结果表明，circPROSC在体外和体内均能够促进MSCs的成骨分化，提示其在颅骨缝合过早中的核心作用。

研究还进一步揭示了circPROSC促进成骨分化的具体机制。通过RNA-seq分析发现，circPROSC过表达后，差异表达基因主要富集于细胞外基质组织、骨矿化和骨形成相关通路。此外，KEGG富集分析表明，Wnt信号通路被circPROSC激活。Wnt信号通路在颅骨发育过程中具有重要作用，其中Wnt3A是调控β-catenin的关键成员，而β-catenin则作为Wnt信号通路的核心分子，调控多个基因的转录。实验结果显示，circPROSC的表达水平与Wnt3A和β-catenin呈正相关，且在颅骨缝合过早患者的颅骨缝合组织中，核内β-catenin水平显著升高，同时其下游靶点LEF1和TCF7的表达也相应增加。通过同时敲低Wnt3A和过表达circPROSC，研究团队发现Wnt3A的抑制显著逆转了circPROSC介导的成骨增强效应，表明circPROSC可能通过调控Wnt3A/β-catenin信号通路来促进MSCs的成骨分化。

进一步研究发现，circPROSC通过与miR-6815-5p结合，发挥其调控作用。miR-6815-5p是circPROSC的潜在靶点，且其在体外实验中被circPROSC过表达所抑制。通过双荧光素酶报告基因实验和FISH分析，研究团队确认了circPROSC与miR-6815-5p的直接结合，并发现miR-6815-5p的过表达能够显著抑制Wnt3A的表达，从而减少circPROSC对成骨过程的促进作用。此外，分子对接和分子动力学模拟分析表明，circPROSC与miR-6815-5p之间的结合具有高度稳定性，且其结合后能够形成一个稳定的复合物。这些发现进一步支持了circPROSC通过调控miR-6815-5p，进而影响Wnt3A/β-catenin信号通路，最终促进MSCs的成骨分化。

为了探索circPROSC在颅骨缝合过早中的治疗潜力，研究团队开发了一种基于MSC膜包被的siRNA纳米颗粒（MM@Lipo/siRNA），该纳米颗粒能够靶向抑制circPROSC的表达。通过体外实验和体内实验，研究团队发现MM@Lipo/siRNA能够显著降低circPROSC的表达水平，并且有效缓解了颅骨缝合过早小鼠模型中的冠状缝合过早闭合现象。此外，治疗后小鼠的骨矿物密度（BMD）和骨体积分数（BV/TV）均显著降低，与未治疗组相比，显示出良好的治疗效果。在行为学实验中，研究团队评估了治疗对小鼠神经行为的影响，发现si-circPROSC能够部分恢复社会互动能力和认知功能，而对运动学习能力无明显改善。这表明，circPROSC的调控不仅能够改善骨骼结构，还可能对相关的神经功能缺陷具有一定的修复作用。

在安全性评估方面，研究团队对MM@Lipo/siRNA在多个器官中的分布进行了检测，并发现其在颅骨缝合区域具有显著的富集效应，而在心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中未观察到明显的信号，表明其具有良好的靶向性和生物相容性。此外，通过免疫组化分析和细胞因子检测，研究团队确认了该纳米颗粒在体内未引起明显的免疫反应，且未对组织造成损害，进一步支持了其在临床应用中的安全性。

研究团队还探讨了circPROSC在不同类型的颅骨缝合过早模型中的功能和应用前景。虽然目前尚未建立成熟的非综合征型颅骨缝合过早小鼠模型，但使用广泛认可的Twist1?/?小鼠模型进行体内实验，结果表明该模型在病理特征上与非综合征型颅骨缝合过早相似，为circPROSC的治疗研究提供了重要的验证平台。然而，由于该模型仍具有一定的遗传异质性，未来需要进一步开发更接近临床情况的非综合征型模型，以全面评估MM@Lipo/siRNA在不同病理背景下的治疗效果。

综上所述，本研究首次发现了circPROSC作为颅骨缝合过早的分子标志物，并揭示了其通过调控miR-6815-5p和Wnt信号通路促进MSCs成骨分化的机制。同时，开发的MM@Lipo/siRNA纳米颗粒为颅骨缝合过早提供了一种非侵入性的治疗策略，具有良好的生物相容性、靶向性和治疗效果。这些发现不仅有助于理解颅骨缝合过早的表观遗传调控机制，也为该疾病的早期诊断和微创治疗提供了新的思路和方法。未来，随着对circRNA调控机制的深入研究，以及新型纳米药物递送系统的开发，circPROSC有望成为颅骨缝合过早治疗领域的重要靶点。