由宿主基因型驱动的紫花苜蓿（Medicago sativa）种子微生物组变化揭示了与驯化相关的多样性丧失现象

《Frontiers in Microbiology》：Host genotype-driven shifts in the Medicago seed microbiome reveal domestication-linked diversity loss in lucerne (Medicago sativa)

种子微生物组与作物驯化相关性的研究：以苜蓿为例，通过整合16S测序、分离培养和全基因组测序，发现野生近缘种种子微生物组多样性显著高于驯化种，且携带更多功能特异的菌群（如Massilia、Duganella）。核心微生物群以Pantoea、Pseudomonas等为主，驯化过程导致菌群多样性降低及功能冗余减少。研究为农业微生物组工程提供资源库和理论依据。

　　种子微生物群是植物相关微生物群落中的一个关键但尚未被充分研究的维度，具有增强作物抗逆性和可持续性的潜力。尽管植物微生物群已经受到广泛关注，但种子相关细菌的多样性和组成，尤其是在野生和驯化谱系之间，仍然缺乏深入的了解。本研究采用整合方法，结合扩增子测序、基于培养的微生物恢复以及代表性菌株的全基因组分析，对苜蓿（*Medicago sativa* L.）及其作物野生近缘种的种子微生物群进行了剖析。扩增子分析揭示了所有样本中存在一个保守的核心微生物群，同时伴随着宿主基因型特异性模式，以及野生近缘种中显著更高的细菌多样性。基于培养的方法成功恢复了超过一半的丰富扩增子序列变体（ASVs），验证了菌株库的代表性。所选菌株的全基因组测序发现了同种内显著的基因组变异，包括在相同物种中存在基因组上不同的菌株。核心类群如*Pantoea*、*Paenibacillus*和*Pseudomonas*在所有样本中都被一致恢复，而一些在野生近缘种中丰富的属，如*Massilia*、*Duganella*和*Sphingomonas*则在驯化种中较为稀有或缺失。比较微生物群分析显示，驯化过程已显著降低了苜蓿种子微生物群的分类丰富度和微生物多样性。保守类群的主导地位以及野生丰富的类群的缺失或稀有，表明育种历史可能影响微生物群落的组装，并可能限制其功能。在所有样本中，核心类群的持续存在与垂直传播以及宿主基因型的共同作用一致，为种子微生物群的结构提供了可能的解释。通过将植物基因型与种子微生物群的组成和可培养性联系起来，本研究提供了对种子微生物群形成过程的高分辨率视角，为苜蓿育种和牧场改良提供了微生物学指导的策略基础。

全球粮食安全在环境和经济压力日益加剧的背景下，需要向更加抗逆和可持续的耕作系统转变。植物相关的微生物群落正被越来越多地认为是作物健康的重要贡献者，它们支持营养获取、抗逆性以及病害抑制等功能。尽管植物-微生物互作的概念可以追溯到20世纪初，当Lorenz Hiltner首次提出“根际效应”的概念时，近年来的研究揭示了根际、内生和叶面微生物群的复杂性和功能性。这些微生物群通过多种途径影响宿主功能，如氮（N）固定、植物激素的产生、磷（P）溶解以及铁的结合。与此同时，微生物接种剂作为环保的替代品，正在成为农业中替代农业化学品的重要手段，一些菌株，如*Azospirillum*、*Azotobacter*和*Bacillus megatherium*已经商业化用于农业应用。

种子形成了一个独特的微生物生态位，对垂直传播和早期植物发育具有重要影响。种子相关的微生物群落包括附着在种子外皮、储存组织和胚乳中的表生和内生菌群，这些菌群可能是通过遗传继承或环境获得。垂直传播的微生物可以影响幼苗的微生物群落组装，从而影响发芽、生长以及对逆境的响应。然而，传统的基于培养的方法往往无法充分代表种子微生物群的完整分类和功能多样性，限制了生态学洞察力和应用潜力。

与植物其他部位类似，种子也寄居着一个“核心微生物群”，即在不同环境和基因型中与宿主一致的微生物类群。这些核心成员受到宿主选择和环境过滤的影响，被认为执行着重要的生态功能。在各种植物物种中，种子微生物群通常由变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）主导。属如*Pantoea*、*Enterobacter*和*Pseudomonas*在大麦、玉米、水稻和向日葵种子中经常被鉴定出来。

驯化过程显著改变了植物的表型、基因组以及相关微生物群落。其主要后果之一是遗传多样性的减少，这在水稻、小麦和普通豆类中都有所体现。在玉米中，某些核心种子相关细菌，包括*Paenibacillus*、*Enterobacter*、*Methylobacterium*、*Pantoea*和*Pseudomonas*在驯化后仍然存在，但野生近缘种通常保留更多的微生物多样性。这些模式表明，驯化可能会限制微生物群落的多样性，并改变植物-微生物互作。虽然这些趋势在谷物中已有充分记录，但在豆科植物的种子层面研究仍较为有限，突显了野生近缘种作为微生物多样性资源的潜力。

苜蓿（*Medicago sativa* L.）是最早被驯化的豆科植物之一，目前是全球和澳大利亚广泛种植的多年生牧草豆科植物。它在可持续耕作系统中具有重要价值，通过固氮、土壤改良和杂草与病害的抑制作用。相比之下，*Medicago*作物野生近缘种（CWRs）由于多样化的自然环境，具有更广泛的适应性特征和潜在更丰富的微生物群落。驯化苜蓿的遗传多样性估计减少了30%，有证据表明其微生物群落也可能呈现出类似的趋势。例如，野生*Medicago*物种*M. polymorpha*在驯化苜蓿品种中宿主植物生长促进（PGP）细菌的含量较少。然而，苜蓿及其CWRs的种子相关微生物群仍处于探索阶段，特别是在多样性、可培养性和应用潜力方面。由于垂直传播的微生物影响早期植物发育，阐明这些微生物群落将有助于未来的微生物接种剂开发和基于微生物群落的育种策略。

本研究旨在表征和比较驯化苜蓿与选定的*Medicago* CWRs的种子相关细菌群落，以评估野生基因型是否携带更多样化和组成不同的微生物群。从澳大利亚商业种子公司获得18个驯化苜蓿品种的种子，以及从利比亚和俄罗斯获得的18个CWRs种子，均来自澳大利亚牧草基因库（APG）。我们假设CWR种子携带的微生物群落比驯化苜蓿更加多样且组成不同。为了保留表生和内生微生物，种子仅用无菌反渗透水冲洗，而未进行表面灭菌。可培养的细菌通过传统微生物学技术与Sanger测序进行分离和鉴定。同时，通过16S rRNA基因扩增子测序对更广泛的群落结构进行了表征，并对部分菌株进行了全基因组测序。这些方法共同提供了对*Medicago*种子微生物群结构和可培养性的整合视角，为基于微生物群落的苜蓿改良策略奠定了基础。

研究方法采用了多种技术手段，以确保对种子微生物群的全面理解。种子的收集和清洗过程遵循严格的标准，以确保微生物群落的完整性。为了获取可培养的细菌，对每个品种的20株健康幼苗进行处理，并在无菌条件下进行分离。同时，通过16S rRNA基因扩增子测序对微生物群落进行整体表征，以揭示其组成和多样性。这些方法结合了传统培养技术与现代分子生物学手段，为种子微生物群的深入研究提供了可靠的框架。

研究结果揭示了*Medicago*种子微生物群的多样性特征。在所有保留的样本中，CWRs表现出显著更高的细菌多样性，其香农多样性指数平均为2.15，而驯化苜蓿为1.55。当按植物种类分组时，*M. laciniata*的种子相关细菌群落比*M. littoralis*、*M. littoralis* var. *littoralis*和*M. sativa*更加多样。在驯化组内，多样性也显著低于*M. sativa* subsp. *falcata*和*M. truncatula*，进一步突显了驯化对种子微生物群多样性的影响。在品种层面，*M. laciniata* APG 21164表现出最高的香农多样性指数（2.57），而驯化苜蓿的Sequel品种则最低（0.97）。在驯化组内，Aurora品种显示出最高的多样性（2.37），表明驯化品种内部也存在显著的基因型差异。

β多样性分析揭示了不同*Medicago*种类之间细菌群落组成的显著差异。基于Jaccard相似性的主坐标分析（PCoA）显示，样本按植物种类形成不同的聚类，驯化苜蓿的样本形成一个中心化的群落，而*Medicago* CWRs则呈现出更分散的、物种特异性的群落结构。使用无加权UniFrac距离进行的统计比较进一步证实了宿主种类间细菌群落组成的显著差异。此外，组内分散性（PERMDISP）测试显示，在多个物种对之间观察到显著的分散性差异，如*M. laciniata*与*M. sativa*、*M. laciniata*与*M. truncatula*、*M. littoralis*与*M. littoralis* var. *littoralis*、*M. sativa*与*M. sativa* subsp. *falcata*和*M. truncatula*之间，以及*M. sativa* subsp. *falcata*与*M. truncatula*之间均存在显著差异。这些结果表明，平均群落组成的变化以及群落结构的变异性是*Medicago*种子微生物群物种级差异的主要原因。

在*Medicago*种子微生物群的分类分析中，共鉴定出107个细菌属。其中，17个属在驯化苜蓿中被检测到，而28个属在CWRs中被发现，每个属的相对丰度均超过0.01%。低于该阈值的属被归类为“其他”。在驯化苜蓿中，细菌群落主要由*Pantoea*（53.64%）、*Paenibacillus*（20.63%）、*Pseudomonas*（16.59%）以及与*Enterobacteriaceae*（3.96%）和*Erwiniaceae*（1.80%）相关的类群组成。相比之下，CWRs中最丰富的属包括*Pantoea*（31.12%）、*Pseudomonas*（27.25%）、*Paenibacillus*（19.80%）、*Massilia*（8.93%）和*Duganella*（4.56%）。在所有鉴定的属中，27个属在驯化和野生样本中均有出现，其中20个属是CWRs特有的，包括*Duganella*、*Hymenobacter*和*Tumebacillus*。驯化苜蓿中有18个属是特有的，但只有*Xanthomonas*的相对丰度超过0.01%。

为了评估宿主基因型/品种对细菌组成的影响，研究对所有36个*Medicago*种子样本进行了属级细菌群落分析。在所有样本中，前三丰富的属为*Pantoea*（33.36–86.63%）、*Pseudomonas*（2.08–38.32%）和*Paenibacillus*（0.004–52.30%）。值得注意的是，*Massilia*在*M. littoralis*和*M. littoralis* var. *littoralis*的样本中被显著富集，但在驯化苜蓿中相对丰度较低。同样，*Duganella*在*M. laciniata*、*M. truncatula*和*M. littoralis* var. *littoralis*中较为丰富，但在驯化样本中则未被检测到。在“Mr Fothergills”品种中，*Methylobacterium-Methylorubrum*被显著富集，而在*M. littoralis* var. *littoralis*中，*Sphingomonas*的相对丰度也较高。在*M. laciniata*中，*Hymenobacter*表现出相对较高的丰度。在*M. truncatula* APG 21771样本中，*Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium*（ANPR-complex）和*Stenotrophomonas*的相对丰度也较高。值得注意的是，*M. sativa* subsp. *falcata*是唯一一个在该亚种中携带*Tumebacillus*的物种。

为了探索微生物群落组成是否受到发育阶段的影响，研究比较了驯化品种“Magna-959”的幼年和成熟种子。两种种子阶段的群落组成相似，仅在成熟种子中观察到*Bacillus*丰度的下降。这些结果表明，该品种在种子成熟过程中微生物群落的组成保持稳定，但为了确认这一趋势是否具有普遍性，还需要在多个样本之间进行更广泛的比较。

研究还发现，CWRs中存在一些低丰度但可能具有功能意义的微生物类群，这些类群在澳大利亚驯化苜蓿品种中具有特异性。这些包括具有植物有益功能的属，如*Asticcacaulis*、*Mucilaginibacter*、*Herbaspirillum*和*Flavobacterium*。此外，一些与人类相关的属，如*Staphylococcus*和*Corynebacterium*也被检测到。这些属的存在可能反映了种子处理过程中不同王国微生物的交换，但它们也被报道为核心植物微生物群的持久低丰度成员，表明人类干预可能无意中塑造了驯化物种的微生物群落。

研究还揭示了CWRs中微生物群落的多样性可能受到宿主基因型和驯化历史的双重影响。CWRs中的微生物群落显示出更广泛的生态复杂性，这可能反映了它们与宿主植物在未受干扰环境中的长期生态关联。这种关联可能支持形成整合且功能多样的微生物群落。相比之下，驯化苜蓿的微生物群落表现出更高的分类丰富度和微生物多样性，这可能受到农业实践和环境条件的影响。此外，一些常见的育种目标，如种子大小、种子外皮特性以及开花期，可能在不经意间选择特定的微生物群落，从而在育种过程中限制微生物多样性。微生物筛选可能从种子阶段开始，并影响根部、根际和叶面微生物群落的组成，进而影响植物发育、免疫互作和逆境适应，如在其他系统中所观察到的那样。

研究还发现，一些核心类群在特定基因型中表现出低丰度，这表明*Medicago*核心微生物群可能具有基因型依赖性。例如，*Bradyrhizobium*，一个仅在*M. littoralis var. littoralis*中被检测到的核心成员，已被报道在其他系统中提供固氮、磷溶解和植物激素的产生。这些发现强调了即使在保守的核心群落中，细微的基因型特异性微生物特征仍然存在。表征*Medicago* CWRs的种子微生物群可能会揭示一些稀有但功能重要的微生物类群，这些类群可能在驯化苜蓿中对胁迫耐受性、营养效率或病害抑制起重要作用。进一步的功能验证将有助于确定这些微生物是否适合用于种子微生物群落的应用或育种策略。

在物种内部，研究发现存在显著的基因组变异，这表明在分类级别上可能需要更严格的界定标准。通过比较基因组相似性，研究发现某些菌株虽然在基因组水平上高度相似，但在生物保护实验中表现出不同的功能结果。这种现象表明，基于基因组相似性的分类可能无法准确反映微生物的功能行为。因此，未来的微生物群落研究需要结合基因组、表型和生态验证，以更精确地识别微生物的多样性，特别是在合成微生物群落（SynComs）设计中，菌株特异性特征比物种身份更可能影响接种剂性能。

研究结果强调了种子微生物群在植物-微生物互作中的重要性。通过整合基于培养的微生物恢复与序列分析，本研究提供了一个稳健且可转移的框架，用于推进种子微生物群落的研究。这些发现不仅加深了我们对种子微生物群落的了解，也为基于微生物群落的作物改良提供了新的视角。通过建立一个功能相关的微生物资源并提出一个可扩展的框架，本研究为下一代、精确设计的微生物解决方案奠定了基础，这些解决方案可以支持作物的抗逆性、营养利用效率和可持续农业的发展。