综述：α1,3-半乳糖基转移酶基因敲除及更多基因修饰猪的异种移植策略全面评述

《Frontiers in Immunology》：Genetically modified pigs with α1,3-galactosyltransferase knockout and beyond: a comprehensive review of xenotransplantation strategies

本综述系统评述了α1,3-半乳糖基转移酶敲除(GT-KO)猪在异种移植领域的核心价值，重点探讨了通过基因编辑技术(如CRISPR/Cas9、SCNT)消除α-Gal表位、表达人源补体调节蛋白(CD46/CD55/CD59)及凝血调节因子(血栓调节蛋白TBM、EPCR)等策略，如何显著改善猪-灵长类器官移植(肾、心、角膜、肺等)的存活率，并指出联合靶向免疫抑制仍是实现长期存活的关键。

　　

1 引言

异种移植为解决人类器官短缺问题提供了希望。猪因其器官解剖结构、生理代谢及免疫系统与人类高度相似，成为最理想的器官供体。然而，猪器官移植后会迅速引发超急性排斥反应(HAR)和急性体液性排斥反应(AHXR)。这两种排斥主要由针对猪血管内皮上α-半乳糖表位(α-Gal)的异种反应性天然抗体所介导。为克服排斥，研究人员正深入探索α1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GT-KO)猪及其他基因修饰（如同时表达人源补体调节蛋白）的应用。本文重点评述了GT-KO猪来源的肾脏、心脏、角膜和肺等器官在异种移植中的应用潜力。

2 导致细胞表面α-Gal表位缺失的基因修饰

为获得基因修饰猪，研究人员可利用多种技术，包括原核与胞质显微注射、体细胞核移植(SCNT)、病毒DNA转导、DNA转座子系统（如Sleeping Beauty和piggyBac）以及位点特异性核酸酶（锌指核酸酶ZFN、转录激活因子样效应物核酸酶TALEN）和基于CRISPR-Cas9细菌免疫系统的改造。这些技术能通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)机制实现精确的基因敲除或插入。例如，通过CRISPR-Cas9成功构建了GGTA1、CMAH和B4GalNT2三重基因敲除(TKO)猪，显著降低了人IgM/IgG抗体结合，减少了猪组织的异种抗原性。此外，表达人源补体调节蛋白（如CD46、CD55）、凝血调节因子（如血栓调节蛋白TBM、EPCR）及免疫调节分子（如CD47、HO-1）的转基因猪，进一步增强了移植物对抗人体免疫系统的能力。

3 α-Gal缺陷猪来源器官评述

3.1 骨源性材料

GT-KO猪骨组织因其免疫原性蛋白成分含量低，是极具潜力的移植材料。研究表明，GT-KO猪骨移植可降低人外周血单核细胞(PBMCs)炎症因子（如TNF-α、IFN-γ）的产生，抑制CD4⁺辅助T细胞活化，并促进成骨标志物（如Runx2、OCN）表达，从而延缓异种排斥并促进新骨形成。

3.2 肾脏

GT-KO猪肾移植在非人灵长类(NHP)模型中取得显著进展。联合表达人源补体调节蛋白（CD46、CD55）和抗凝基因（CD39、TBM）的转基因猪肾，可避免HAR，并延长移植物存活数周甚至数月。关键策略包括使用抗CD40/CD154共刺激通路阻断的免疫抑制方案，以及消除非Gal抗原（如Neu5Gc、SD(a)）。临床前数据显示，经过基因修饰的猪肾移植在人体试验中已实现短期功能正常，无HAR发生，但仍需克服T细胞介导的排斥和抗体介导的排斥(AMR)。

3.3 心脏

猪心异种移植存活时间从几小时延长至数月，得益于多基因编辑（如GT-KO结合hCD46、hTBM、hEPCR等表达）及免疫抑制方案（如抗CD40抗体）。GT-KO猪心包材料可减少人抗Gal抗体介导的生物瓣钙化，提高瓣膜耐久性。近期临床案例显示，10基因编辑猪心在人体内支持生命达数周，但仍面临舒张功能障碍和心肌增厚等挑战，提示需进一步优化抗体介导排斥的防控策略。

3.4 肺

肺异种移植因凝血障碍和复杂免疫反应面临严峻挑战。GT-KO联合表达人CD55、CD59及CD39的猪肺在离体灌注模型中显示血栓形成减轻，但长期功能维持仍需解决凝血失调问题。去细胞化GT-KO猪肺支架可延迟免疫细胞浸润，降低T细胞介导的慢性反应，为组织工程肺提供可能。

3.5 角膜

猪角膜因无血管性而免疫原性较低，但移植至高危（血管化）受体时仍需抑制B细胞和补体激活。GT-KO猪角膜可减少人抗体结合，但联合抗CD20抗体治疗或局部免疫抑制才能延长移植物存活。去细胞化猪角膜支架能支持角膜内皮细胞再生，为长期存活提供基础。

3.6 GT-KO细胞及细胞系

GT-KO猪来源的脂肪间充质干细胞(pAdMSCs)显示跨异种屏障的免疫调节功能，可抑制人PBMCs增殖。表达人CD46或CD55的猪主动脉内皮细胞(pAECs)能降低补体介导的细胞毒性和凝血激活。六基因编辑（TKO/hCD55/hTM/hEPCR）猪细胞展现出与人血液的良好相容性，预示其临床应用潜力。

4 GT-KO猪异种移植的未来方向与局限

尽管基因编辑（如多基因敲除和人源蛋白表达）可克服先天免疫反应，但长期排斥防治仍需联合靶向免疫抑制（如B/T细胞耐受诱导）。完全消除α-Gal表位仍存挑战（残留约2%），可能与其他糖基转移酶（如iGb3S）活性有关。同时，过度表达多个保护基因可能带来冗余风险，且跨物种感染（如猪内源性逆转录病毒PERV）安全性需持续评估。未来研究应聚焦于优化基因组合，降低外源性免疫抑制需求，并实现器官与人体免疫系统的完美兼容。

5 结论

GT-KO猪器官异种移植是解决器官短缺的重要途径。消除α-Gal表位及表达人源保护蛋白可显著改善移植物存活，但联合免疫抑制策略对实现长期耐受至关重要。未来需进一步探索基因修饰的精准平衡，以推动异种移植的临床转化。