一种专攻groEL基因终止密码子的细菌II型内含子展现高效位点特异性逆转座活性

《Mobile DNA》：A specialized bacterial group II intron is a highly efficient retrotransposon

本研究针对插入在大肠杆菌应激反应基因groEL终止密码子中的特殊IIB1亚型内含子EcKTE56.groEL，通过建立两种过表达系统，首次证实该内含子是具有高效位点特异性的逆转座子，其天然全长形式在低表达条件下仍保持高活性。研究发现其特有的Ia亚结构域对逆转座效率具有重要调控作用，且染色体整合版本在生理条件下仍能产生功能性逆转座颗粒。这项发表于《Mobile DNA》的研究为理解细菌II型内含子基因组定殖策略提供了新模型。

　　

在细菌基因组中，隐藏着一类独特的"分子寄生虫"——II型内含子。这些由自剪接核酶和内含子编码的逆转录酶组成的复合移动元件，是细菌中最丰富的逆转座子类型。它们通常像"谨慎的房客"，选择插入基因组的非编码区或其他可移动遗传元件中，以最小化对宿主功能的干扰。然而，自然界中总存在例外——一些II型内含子"胆大包天"地侵入了宿主的看家基因。

特别引人注目的是一类特殊的IIB1亚型内含子，它们专门定殖在关键看家基因的起始或终止密码子区域。这类内含子最显著的特征是在其结构域I的基部环区携带一个大型的5'-近末端插入序列（称为Ia亚结构域）。尽管这类内含子在自然界分布广泛，但它们的移动机制和功能特性却长期笼罩在神秘面纱中。其中，来自固氮菌（Azotobacter vinelandii）的Avi.groEL内含子是这类内含子中唯一被部分研究的代表，它插入在热休克蛋白基因groEL的终止密码子中。然而，这类内含子的移动活性及其Ia亚结构域的功能意义，始终是未解之谜。

解开这些谜题对于理解II型内含子如何进化出特殊策略来殖民特定基因组位点具有重要意义。正是基于这一背景，Gomes等研究人员在《Mobile DNA》上发表了他们的最新发现，他们对在大肠杆菌KTE56菌株中发现的EcKTE56.groEL内含子进行了系统研究，这项研究不仅揭示了这一特殊内含子的惊人活性，还为理解II型内含子的基因组定殖策略提供了新的视角。

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：建立了基于T7和阿拉伯糖诱导的两种过表达系统来评估内含子移动活性；通过基因工程构建了野生型、ORF缺失型（△ORF）和催化失活突变型（YAHH）等多种内含子变体；利用菌落PCR和纳米孔全基因组测序技术检测和验证逆转座事件；通过构建含有染色体整合内含子拷贝的工程菌株，研究内源表达条件下的逆转座活性。

The specialized subgroup IIB1 intron EcKTE56.groEL is a highly active retrotransposon

研究人员首先通过生物信息学分析，在多个大肠杆菌菌株中鉴定出完整的"groEL"内含子变体。EcKTE56.groEL内含子具有典型的IIB1亚型结构特征，包括最近发现的EBS2a-IBS2a碱基配对相互作用。与EcI5内含子（一种已被充分研究但不属于特殊IIB1分支的IIB1内含子）相比，两者在序列上具有高度相似性（RT酶56%氨基酸一致性，去除Ia亚结构域和ORF区后的核酶70%序列一致性），但EcKTE56.groEL具有特有的Ia亚结构域。

通过建立基于供体质粒的移动性检测系统，研究人员惊讶地发现，全长野生型EcKTE56.groEL内含子表现出极高的逆转座效率，在IPTG诱导过表达条件下，其逆转座频率接近100%。更令人意外的是，即使在其天然完整形式（3228 nt）下，该内含子也能达到如此高的移动水平，而缩短的intron_△ORF版本并未显示出明显的效率优势，这与之前对其他II型内含子系统的观察结果形成鲜明对比。

测序分析证实，内含子精确插入宿主groEL基因终止密码子（UAA）的第二和第三位核苷酸之间，将其转变为UAG终止密码子，完美重现了在天然基因组中观察到的插入模式。值得注意的是，研究人员还发现了内含子串联整合的现象，特别是在intron_△ORF版本中，串联整合频率高达22.4%，而全长版本中为4.2%。这种串联整合可能得益于EBS3位点为尿苷（U），使其能与第一个整合内含子拷贝的首位核苷酸（G）形成EBS3(U)-IBS3(G)摆动配对。

Deletion of subdomain Ia significantly reduces intron mobility

为了探究Ia亚结构域的功能，研究人员比较了野生型内含子和缺失Ia亚结构域的突变体（EcKTE56.groEL_△Ia）的逆转座效率。在过表达条件下，两者效率相当；然而在低表达（无IPTG）条件下，突变体的逆转座效率比野生型降低了约8倍，这表明Ia亚结构域在逆转座途径的某个阶段发挥着重要作用。尽管其具体分子机制尚待阐明，但可能涉及促进分支途径（套索形成）的剪接，或作为细胞因子（蛋白质或RNA）的特异性结合位点。

An alternative over-expression system to study EcKTE56.groEL mobility in E.coli

为了扩展研究范围，研究人员开发了一种新的阿拉伯糖诱导表达系统（pTara:500/pBR322），该系统不需要在宿主基因组中整合T7 RNA聚合酶基因。在大肠杆菌MG1655菌株中，利用这一系统证实了EcKTE56.groEL_WT内含子同样具有高逆转座效率，而TPRT失活的YAHH突变体仍无整合事件。这一新系统为在不同遗传背景下研究内含子移动性提供了便利工具。

Retrohoming activity generated from a chromosomal copy of the EcKTE56.groEL intron

最令人振奋的发现是，一旦整合到宿主groEL基因的终止密码子中，EcKTE56.groEL内含子仍然是一个活跃的逆转座元件。研究人员构建了含有染色体整合内含子拷贝的工程菌株（MG1655+Intron_12），并在生理温度（37°C）下检测到了其向受体质粒靶位点的忠实逆转座事件。这表明，在天然遗传位点，宿主RNA聚合酶在转录groE操纵子（groES-groEL基因）后能够继续合成，产生足够量的全长内含子前体转录本，这些转录本随后通过内含子自剪接进行处理，形成具有逆转座能力的RNP颗粒。

Discussion

本研究首次全面表征了EcKTE56.groEL这一新型IIB1内含子，揭示了其作为高效位点特异性逆转座子的独特性质。其逆转座频率高达约100%，使其成为迄今为止研究过的最活跃的内含子之一，与EcI5和Th.e.I3内含子并列。尤为值得注意的是，尽管EcKTE56.groEL内含子尺寸巨大（3228 nt），但其天然全长形式仍能实现如此高水平的移动，这挑战了"RNA长度是II型内含子移动性限制因素"的传统认知。

研究人员推测，EcKTE56.groEL内含子的高移动性可能部分归因于其与核糖体的关联，从而有效逃避RNA降解。然而，与乳酸乳球菌Ll.LtrB内含子（IIA亚型）不同，后者与核糖体的相互作用涉及结构域I和IV中的RNA结构，而这些结构在IIB1亚型内含子中大多不保守，因此EcKTE56.groEL可能采用了不同的分子相互作用机制。

Ia亚结构域的功能是本研究另一个重要发现。其在低表达条件下对逆转座效率的显著促进作用（缺失导致效率下降8倍）提示了多种可能性：可能通过促进分支途径剪接来有利于逆转座；也可能作为细胞因子的结合位点，既保护内含子RNA免受降解，又可能主动"引导"RNP至其靶位点（groEL基因的终止密码子）。虽然需要进一步的遗传和生化研究来验证这些假设，但EcKTE56.groEL内含子卓越的移动性使其成为解决这些重要问题的理想模型系统。

此外，染色体整合版本在生理条件下仍能产生可检测的逆转座活性这一发现具有重要意义。这不仅表明内含子能够从天然位点表达，还暗示了其剪接过程可能与翻译过程存在偶联，核糖体覆盖groEL终止密码子区域可能影响内含子5'-末端结构的折叠，从而调节内含子的自剪接过程。

综上所述，EcKTE56.groEL内含子作为一个高效且特异的逆转座子，结合groEL基因在变形菌门中的高度序列保守性，预示着其在天然γ-变形菌菌株间具有巨大的传播潜力。这项研究不仅揭示了一种新型II型内含子模型系统，还为未来探索II型内含子殖民特定基因组位点的新策略奠定了坚实基础。