KDM4A作为α-微管蛋白去甲基酶调控微管聚合与细胞分裂的新机制

《SCIENCE ADVANCES》：KDM4A serves as an α-tubulin demethylase regulating microtubule polymerization and cell mitosis

本研究针对α-微管蛋白K40位点三甲基化（α-TubK40me3）的动态平衡调控机制及其细胞功能尚不明确的问题，揭示了组蛋白去甲基酶KDM4A能够作为α-微管蛋白的“擦除器”，通过其催化核心结构域直接结合并去甲基化α-微管蛋白，从而调控微管聚合动态和细胞有丝分裂进程。该发现不仅拓展了KDM4A的非组蛋白功能，也为理解微管修饰密码在细胞分裂中的精确调控提供了新视角。

　　

在细胞的生命活动中，微管作为细胞骨架的重要组成部分，扮演着如同高速公路般的角色，负责细胞内物质的运输、细胞形态的维持以及至关重要的细胞分裂过程。微管是由α/β-微管蛋白异二聚体组装而成的动态管状结构，其功能和特性受到多种机制的精细调控，其中就包括微管蛋白的翻译后修饰。这些修饰如同刻在微管上的“密码”，被生动地称为“微管密码”，它们决定了微管的稳定性、动态性以及与不同分子相互作用的特异性。在众多修饰中，位于α-微管蛋白第40位赖氨酸上的三甲基化（α-TubK40me3）是一种近年来新发现的修饰，它富集于有丝分裂纺锤体和中间体，对细胞分裂和神经元发育至关重要。此前，科学家们已经找到了催化这一修饰的“书写器”——SETD2，以及识别这一修饰的“阅读器”——PBRM1。然而，负责擦除这一修饰、从而维持其动态平衡的“擦除器”一直悬而未决，α-TubK40me3的动态平衡对细胞的具体影响也仍是未解之谜。

为了解开这个谜团，一项发表在《科学进展》（SCIENCE ADVANCES）上的研究展开了深入探索。研究人员将目光投向了组蛋白去甲基酶家族的一员——KDM4A。KDM4A原本被认为是细胞核内的表观遗传调控因子，主要负责去除组蛋白H3第9和第36位赖氨酸上的甲基化修饰（H3K9me3/H3K36me3），从而影响基因转录。但这项研究意外地发现，KDM4A同样存在于细胞质中，并且与α-微管蛋白存在相互作用。那么，KDM4A是否就是那个神秘的、负责擦除α-微管蛋白甲基化的“擦除器”呢？它又是如何影响微管功能和细胞行为的？

为了回答这些问题，研究团队运用了多种关键技术方法。他们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了KDM4A基因敲除的HEK293T细胞系，并建立了一种称为降解标签（dTAG）的系统，能够快速、可逆地降解KDM4A蛋白，从而在短时间内观察其功能缺失的影响。通过免疫共沉淀、GST pull-down等生物化学方法，他们证实了KDM4A与α-微管蛋白之间的直接相互作用。体外去甲基化实验则直接证明了KDM4A具有去除α-微管蛋白K40位点三甲基化的酶活性。此外，研究人员还通过细胞成像、微管聚合/解聚分析、以及有丝分裂进程的详细观察，系统评估了KDM4A缺失对微管动力学和细胞分裂的影响。

KDM4A通过其催化核心结构域结合α-微管蛋白

研究人员首先通过序列比对发现，α-微管蛋白K40周围的保守序列“KTIGG”与KDM4A已知的组蛋白底物结构特征相似，提示KDM4A有可能识别并作用于α-微管蛋白。细胞免疫荧光和细胞组分分离实验证实KDM4A确实定位于细胞核和细胞质。进一步的免疫共沉淀实验表明，内源性的KDM4A和α-微管蛋白能够相互结合，并且这种结合不依赖于α-微管蛋白K40位点的修饰状态（无论是野生型、无法甲基化的K40A突变体，还是模拟三甲基化的K40F突变体）。通过构建一系列KDM4A的截短体并进行GST pull-down实验，研究人员将KDM4A与α-微管蛋白的结合区域精确锁定在其催化核心结构域——JmjN/JmjC结构域。尤为重要的是，微管共沉降实验显示，KDM4A更倾向于与聚合状态的微管结合，而非可溶性的微管蛋白二聚体。

KDM4A去甲基化α-微管蛋白并降低α-TubK40me3水平

在确认结合的基础上，研究人员开始验证KDM4A的酶活功能。他们在HEK293T细胞中过表达KDM4A，发现能够显著降低α-TubK40me3的水平，而过表达酶活失活的KDM4A^H188A突变体则无此效果。相反，利用CRISPR-Cas9技术敲除KDM4A后，细胞内的α-TubK40me3水平显著升高，而α-微管蛋白K40位点的乙酰化（α-TubK40ac）等其他修饰则不受影响。为了排除KDM4A在细胞核内通过影响基因表达间接起作用的可能性，研究人员构建了带有核输出信号（NES）的KDM4A截短体，将其强行定位在细胞质。结果发现，仅包含催化核心结构域（1-350氨基酸）的KDM4A截短体就足以降低α-TubK40me3水平，而不影响组蛋白H3K36me3的修饰水平。最直接的证据来自体外实验：将纯化的重组KDM4A蛋白与纯化的微管蛋白或化学合成的α-TubK40me3多肽共同孵育，可以观察到明显的去甲基化效果。这些结果强有力地证明KDM4A是α-微管蛋白的直接去甲基酶。

KDM4A缺失促进微管聚合并导致有丝分裂缺陷

既然KDM4A调控α-TubK40me3水平，那么这种调控对微管功能有何影响？研究人员发现，敲除KDM4A的细胞在解除微管解聚药物诺考达唑（nocodazole）的处理后，微管重新聚合的速度和强度都显著高于野生型细胞。细胞内的微管蛋白可以分成可溶性部分（S）和聚合部分（P），KDM4A敲除细胞的P/S比值明显升高，表明聚合微管的比例增加。通过活细胞成像追踪微管正端标记蛋白EB3的运动，发现KDM4A敲除细胞中微管生长速度加快。这些结果一致表明，KDM4A的缺失（导致α-TubK40me3水平升高）促进了微管的聚合。由于α-TubK40me3在有丝分裂期富集，研究人员进一步观察了细胞分裂过程。果然，KDM4A敲除细胞表现出严重的有丝分裂异常：在分裂中期，出现多极纺锤体的细胞比例显著增加；在分裂后期和末期，则观察到染色体滞后、染色体桥以及微核等异常现象。这些缺陷可以通过重新引入有活性的KDM4A或其催化核心域来挽救，但酶活失活的突变体则无效。

dTAG介导的KDM4A降解增加α-TubK40me3并引起有丝分裂缺陷

为了更精确地解析KDM4A的即时功能，并区分其去甲基化酶活性和潜在的转录调控功能，研究人员采用了dTAG快速降解系统。他们在KDM4A基因的N端引入了FKBP12^F36V降解标签，构建了KDM4A-dTAG细胞系。加入小分子降解剂dTAG-13后，KDM4A蛋白在2小时内即可被有效降解。降解2小时后，α-TubK40me3水平即有轻微上升，但细胞有丝分裂未见明显异常；而降解12小时后，α-TubK40me3水平大幅升高，并伴随着与KDM4A敲除细胞相似的有丝分裂缺陷。尽管组蛋白H3K36me3的水平也因KDM4A降解而升高，但转录组（RNA-seq）和蛋白质组学分析显示，降解12小时后仅有极少数基因和蛋白的表达发生微小变化，且这些变化与有丝分裂缺陷无直接关联。这表明，短期内KDM4A缺失所引起的有丝分裂问题，主要源于其对α-微管蛋白的直接去甲基化功能失调，而非间接的转录调控效应。

降低高水平的α-TubK40me3或微管过度聚合可挽救KDM4A缺失引起的有丝分裂缺陷

最后，研究人员通过两种策略来“挽救”KDM4A缺失造成的表型。第一种策略是直接降低α-TubK40me3水平。他们在KDM4A敲除细胞中过表达α-微管蛋白K40A突变体（该突变体不能被甲基化）。由于K40A突变体能够整合进微管网络，它有效地“稀释”了整体的α-TubK40me3水平。结果，这些细胞的有丝分裂缺陷得到了显著改善。第二种策略是干预微管的过度聚合。他们使用低浓度（50 nM）的诺考达唑处理KDM4A敲除细胞，发现这种处理能够将升高的P/S比值降低至接近野生型水平，同样有效地挽救了有丝分裂缺陷。这两项实验互为佐证，表明KDM4A缺失导致有丝分裂缺陷的根本原因，确实是α-TubK40me3水平过高所引起的微管过度聚合。

综上所述，这项研究成功地鉴定出组蛋白去甲基酶KDM4A是α-微管蛋白K40位点三甲基化的“擦除器”，揭示了其在细胞质中调控微管动态和保障细胞分裂正常进行的关键作用。研究结论和讨论部分强调，KDM4A通过其催化核心域直接结合并去甲基化聚合状态的微管，从而维持α-TubK40me3水平的动态平衡。这种平衡对于微管保持适当的聚合状态至关重要。一旦平衡被打破，无论是KDM4A缺失导致的过度甲基化（本研究），还是SETD2缺失导致的甲基化不足（既往研究），都会引起微管动力学异常，最终导致有丝分裂错误和基因组不稳定性。这项工作极大地拓展了人们对KDM4A功能的认识，将其从传统的核内表观遗传调控因子，延伸至细胞质内的细胞骨架重塑因子，建立了表观遗传调控与细胞骨架动力学之间的直接联系。对“微管密码”中甲基化修饰动态平衡机制的深入理解，不仅具有重要的理论意义，也为研究与细胞分裂异常相关的疾病（如癌症）提供了新的潜在靶点和思路。