Calpain-2缺失通过抑制TGF-β信号通路减弱A549肺癌细胞的上皮-间质转化及侵袭能力

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Loss of Calpain-2 Attenuates TGF-β–Driven Epithelial–Mesenchymal Transition and Invasive Behavior in A549 Lung Cancer Cells

本研究通过CRISPR/Cas9技术构建calpain-2基因敲除的A549肺癌细胞模型，首次系统揭示calpain-2缺失可通过抑制MMP-2/MMP-9活化、破坏肌动蛋白重构及下调Snail/Slug/ZEB1等转录因子，显著减弱TGF-β诱导的上皮-间质转化（EMT）和细胞侵袭行为，为靶向calpain-2抑制肺癌转移提供了新策略。

　　

Materials（材料）

兔源抗calpain-2多克隆抗体通过合成肽段（AGIAMKLAKDREAAEGLGSHE）与钥孔血蓝蛋白（KLH）偶联后免疫家兔制备。首次皮下注射0.2 mg KLH-肽段偶联物，后续进行四次0.3 mg的加强免疫。

Generation of Calpain-2 knockout A549 cell lines（Calpain-2基因敲除A549细胞系的构建）

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，我们在人肺癌A549细胞系中成功构建了calpain-2纯合敲除模型。通过流式细胞分选技术（FACS）筛选ZsGreen荧光阳性细胞，采用有限稀释法在96孔板中分离单克隆。对多个独立克隆进行DNA测序发现，其中一个克隆的calpain-2基因第4外显子存在纯合 indel突变。

Discussion（讨论）

本研究首次通过CRISPR/Cas9技术构建calpain-2敲除A549细胞，系统评估了其与对照细胞在迁移和侵袭能力方面的差异。同时，我们探究了TGF-β（一种调控细胞增殖、迁移、分化和EMT的关键细胞因子）对calpain-2功能的影响。

首先，划痕实验结果表明，在TGF-β刺激下，calpain-2敲除细胞的迁移能力显著减弱。进一步通过Transwell侵袭实验发现，calpain-2缺失使细胞穿越基质胶的能力下降约60%。这些现象与肌动蛋白细胞骨架重构异常密切相关——calpain-2敲除细胞中应力纤维形成减少，伪足动态活动明显受限。

分子机制研究表明，calpain-2缺失导致MMP-2和MMP-9的酶原活化水平降低。更有趣的是，EMT关键转录因子Snail、Slug和ZEB1的表达在TGF-β刺激下显著下调，同时上皮标志物E-钙黏蛋白表达上调，而间质标志物N-钙黏蛋白和波形蛋白表达下降。这些发现提示calpain-2可能通过多重分子通路协同调控EMT进程。

Conclusion（结论）

本研究证实calpain-2缺失能显著抑制A549细胞的迁移和侵袭能力，这些过程在癌症转移中起关键作用。该发现不仅凸显了calpain-2在调控肿瘤转移行为中的核心地位，更表明靶向calpain-2可能成为抑制癌症进展的新兴治疗策略。