基于多重探针实时PCR检测CRISPR-Cas9编辑的单核苷酸缺失番茄及非转基因特性确认的案例研究

《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》：Detection method for CRISPR-Cas9 edited tomato with single nucleotide deletion using multiplex probe-based real-time PCR and confirmation of non-transgenicity: A case study

本研究针对CRISPR-Cas9基因编辑番茄中单核苷酸缺失的检测难题，开发了基于LAMP快速筛查和多重TaqMan?实时PCR的检测体系。研究人员通过设计同时靶向编辑和未编辑序列的双探针，实现了对SlPL基因单碱基缺失的精准检测，灵敏度达0.1%，并验证了编辑株系不含转基因元件。该研究为SDN-1/SDN-2型基因编辑作物的监管验证提供了关键技术支撑。

　　

随着CRISPR-Cas9基因编辑技术的快速发展，番茄等重要农作物正通过精准基因组编辑获得改良性状。然而，基因编辑作物（GE）的监管检测面临独特挑战：与传统转基因（GM）作物不同，SDN-1和SDN-2类型的基因编辑通常仅产生单个或少数核苷酸的微小变异，且不携带外源转基因元件，这使得常规检测方法难以适用。特别是在印度等国家对SDN-1/SDN-2作物实行监管豁免的背景下，开发可靠的编辑验证技术对确保生物安全监管和国际贸易合规性至关重要。

针对这一技术瓶颈，印度农业研究理事会国家植物遗传资源局的Monika Singh团队在《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》发表研究，以携带SlPL（Solanum lycopersicum pectate lyase）基因单碱基缺失的CRISPR-Cas9编辑番茄为模型，建立了一套完整的检测方案。该研究创新性地采用分步策略：首先通过靶向Cas9蛋白基因的环介导等温扩增（LAMP）和常规PCR进行早期转化体筛查，进而开发多重TaqMan?实时PCR方法，利用FAM和HEX双标记探针同时靶向编辑和未编辑序列，通过"负选择"原理（突变位点信号缺失）实现单核苷酸缺失的精准检测。

关键技术方法包括：1）基于Cas9基因的LAMP快速检测（60°C等温扩增，SYBR Green I显色）；2）针对SlPL基因编辑位点的多重探针实时PCR（探针P1靶向编辑序列，P2靶向未编辑区域）；3）转基因元件筛查（P-35S启动子和T-nos终止子检测）。研究材料涵盖野生型GAT5番茄和Anand农业大学开发的SlPL基因编辑株系（T₀代），以及8个商品化番茄品种作为对照。

研究结果

早期筛查验证Cas9蛋白基因

研究人员设计的LAMP检测体系通过特异性引物（F3/B3，FIP/BIP）在60分钟内即可通过颜色变化（橙变绿）直观判断Cas9存在情况。实验显示该体系仅在被编辑株系中产生阳性信号，野生型和其他番茄品种均为阴性，证实其特异性。常规PCR进一步验证了172bp特异性条带仅出现在编辑株系中，为早期转化体筛选提供了可靠工具。

单核苷酸缺失的多重实时PCR检测

通过优化引物探针浓度（P1 0.2μl，P2 0.4μl）、模板DNA量（300ng）和退火温度（59.3°C），建立了稳定的检测体系。在野生型中，靶向编辑序列的探针P1（Ct=25.668±0.61）和未编辑区域探针P2（Ct=30.562±0.67）均产生扩增；而在编辑株系中，仅P2显示扩增（Ct=22.652±0.48），成功实现"负选择"检测。灵敏度测试表明，该方法可稳定检测到0.1%的编辑株系DNA，标准曲线R²>0.981，扩增效率93-103%，符合欧盟对单核苷酸变异检测的验证标准。

非转基因状态确认

通过对全球已批准转基因番茄事件的分析，选择P-35S启动子和T-nos终止子作为筛查指标。实时PCR结果显示编辑株系中这两个元件均为阴性，而阳性对照Ct值分别为22.02和24.11，证实该SDN-1型编辑株系不含外源转基因成分，符合印度生物安全指南对SDN-1/SDN-2类作物的监管要求。

本研究建立的检测体系具有重要应用价值：LAMP方法适用于现场快速筛查，而多重实时PCR技术为单核苷酸编辑提供了经济高效的检测方案（相较于NGS和ddPCR）。该策略可推广至其他作物的基因编辑检测，特别是对SDN-1/SDN-2型作物的监管验证、育种材料鉴定和国际贸易合规性检查具有突出意义。随着全球基因编辑作物商业化进程加速，这种兼顾灵敏度（0.1%）、特异性与成本效益的检测方法，将为建立统一的基因编辑作物监管标准提供技术支撑。