《Analytica Chimica Acta》：Boosting Split-crRNA CRISPR/Cas12a Activity by 3’-End Extension of DNA Activator for Direct MicroRNA Sensing
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CRISPR/Cas12a系统通过split-crRNA设计实现直接miRNA检测，利用3’-端24核苷酸随机序列延伸DNA激活子显著提升荧光信号（6.4倍），检测限达0.6 pM，线性范围5 pM-1 nM，在稀释血清中验证回收率98%-106%。
林后|阮芳琪|赵凯伦|李宝鑫
教育部应用表面与胶体化学重点实验室，陕西省生命科学分析化学重点实验室，陕西师范大学化学与化工学院，西安710119，中国
摘要
背景
CRISPR/Cas12a独特的跨切割活性在生物传感领域得到了广泛应用。然而，使用传统的CRISPR/Cas12a系统检测miRNA需要核酸扩增或逆转录将miRNA转化为DNA，这会增加反应时间并增加污染的风险。
结果
本研究提出了一种基于split-crRNA的CRISPR/Cas12a生物传感方法，用于直接检测miRNA。目标miRNA-375被用作crRNA的间隔区，从而促进其与截短支架RNA的结合，形成完整的crRNA。更重要的是，我们发现通过在DNA激活剂的3’端添加随机序列，显著增强了split-crRNA CRISPR/Cas12a的切割活性。与传统的split-crRNA CRISPR/Cas12a系统相比，在DNA激活剂的3’端添加24个核苷酸随机序列后，其活性提高了6.4倍。本文讨论了3’端扩展的增强机制。该split-crRNA CRISPR/Cas12a系统用于检测miRNA-375，线性范围为5 pM?1 nM，检测限估计为0.6 pM（3σ）。此外，该系统还用于在10%稀释的人血清中检测miRNA-375，获得了令人满意的回收率（98%?106%）。
意义
这一发现表明，通过延长DNA激活剂的3’端可以增强split-crRNA CRISPR/Cas12a的活性，从而实现高灵敏度的直接miRNA检测。这是一种简单而有效的提高直接miRNA检测灵敏度的策略。
引言
近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关系统（Cas）作为有效的核酸和各种生物标志物检测工具受到了广泛关注，因为它们具有独特的特性，包括能够切割旁观目标、在温和的反应条件下运行以及在目标识别方面表现出高特异性[[1], [2], [3]]。特别是Cas12a能够在存在短近端间隔区（PAM）的情况下识别双链DNA（dsDNA），以及识别序列互补的单链DNA（ssDNA）[[4], [5], [6]]。这些DNA链以位点特异性被切割，而非特异性的跨切割则发生在任何ssDNA周围[7], [8]。通常，Cas12a系统的活性需要DNA激活[5]。使用Cas12a系统检测miRNA需要通过额外的核酸扩增过程[9], [10], [11], [12], [13]、逆转录[14]或链置换[15]将miRNA目标转化为DNA分子，从而激活Cas12a系统。这些过程不仅会增加反应时间，还会增加样品污染的可能性[16]。Cas13a可以直接检测miRNA，但它依赖于比Cas12a使用的ssDNA探针更昂贵且不稳定的RNA探针[17]。对RNA探针的依赖性增加了获得假阳性结果的概率，并增加了检测成本。因此，基于Cas12a开发新的诊断工具对于有效解决这些问题至关重要。
近年来，开发了由split crRNA、激活剂DNA和完整的Cas12a蛋白组成的split-crRNA CRISPR/Cas12a系统[18]。split crRNA由支架RNA和间隔RNA组成。在没有间隔RNA的情况下，“Cas12a-支架RNA-激活剂DNA”复合物没有表现出任何核酸酶活性[19], [20]。间隔RNA通常包含约20个核苷酸，与miRNA相似。如果使用目标miRNA作为间隔RNA，split-crRNA CRISPR Cas12a系统可以直接检测miRNA。因此，split-crRNA策略使CRISPR Cas12a系统能够直接检测从DNA到RNA的靶标[19]。然而，与研究CRISPR Cas12a系统用于DNA检测或间接RNA检测的研究[21], [22], [23], [24], [25], [26]相比，关于split-crRNA CRISPR/Cas12a系统用于RNA检测的研究还处于初级阶段，对其在生物传感应用中的机制了解有限。
在这项研究中，我们旨在开发一种简单而有效的策略来提高split-crRNA CRISPR/Cas12a直接检测miRNA的灵敏度。在优化split-crRNA CRISPR/Cas12a系统时，我们偶然发现延长激活剂DNA的3’端可以显著增强荧光信号。阐明了扩展的结构参数（包括序列长度、核苷酸组成和二级结构）对增强效果的影响。在3’端引入24个核苷酸随机序列后，信号增强了6.4倍。我们进一步探讨了这种增强Cas12a催化效率的潜在机制。为了证明其实用性，这一增强原理被成功应用于建立了一种简单的荧光检测方法，通过检测miRNA-375进行了验证。这一进展有望加速开发出用于直接检测miRNA生物标志物的灵敏split-crRNA CRISPR/Cas12a生物传感器。
部分片段
试剂和材料
所有使用的DNA序列均由上海桑根生物技术有限公司通过HPLC合成和纯化，RNA由上海GenePharma有限公司制备（见表S1）。LbaCas12a和10 × NEBuffer 2.1购自New England Biolabs, Inc.（美国Ipswich）。RNase抑制剂购自Med Chem Express（美国新泽西州）。
动力学分析程序
5 μL 50 nM LbaCas12a，5 μL 100 nM支架RNA，5 μL 100 nM DNA激活剂，5 μL 5 μM TaqMan探针，以及5 μL 10, 25, 50, 75, 100 nM目标DNA激活剂序列对split-crRNA CRISPR/Cas12a活性的影响
为了探索split-crRNA CRISPR-Cas12a系统的基本特性，我们首先研究了ssDNA激活剂长度对该系统跨切割活性的影响。初始DNA激活剂是与split-crRNA的间隔RNA完全互补的序列。初始DNA激活剂从3’端或5’端进行延长。延长的DNA激活剂分别表示为DNA3’+x（x为核苷酸数量）和DNA5’+x。
结论
在这项研究中，我们发现延长激活剂DNA的3’端可以显著增强split-crRNA CRISPR/Cas12a系统的活性。充分利用这一有趣的现象，我们提出了一种基于CRISPR/Cas12a的直接miRNA检测方法。该方法克服了传统CRISPR/Cas12a系统用于RNA检测的局限性，避免了繁琐的核酸扩增或逆转录步骤。这项研究扩展了CRISPR/Cas12a的应用范围
CRediT作者贡献声明
林后：数据整理、研究、方法论、撰写——初稿。阮芳琪：研究、方法论。赵凯伦：方法论。李宝鑫：概念构思、资金获取、监督、撰写——审稿与编辑
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号21974082）和陕西省自然科学基础研究计划（项目编号2025SYS-SYSZD-012）的财政支持。
