将封装蛋白重编程为模块化固碳纳米隔室：构建合成二氧化碳浓缩机制的新策略

《Nature Communications》：Reprogramming encapsulins into modular carbon-fixing nanocompartments

本研究针对C3作物光合效率低下的难题，开发了一种基于Quasibacillus thermotolerans封装蛋白(QtEnc)的合成生物学平台。研究人员通过C末端货物加载肽(CLP)融合策略，成功将三种不同亚型的Rubisco（核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶）封装于纳米隔室内，并保持其CO2固定活性。该研究为植物兼容型合成羧酶体的构建提供了简化且可扩展的技术路径，对提高作物产量具有重要意义。

　　

在全球人口持续增长和气候变化加剧的背景下，提高作物光合效率已成为保障粮食安全的关键挑战。C3作物如小麦、水稻和大豆的光合作用效率受到Rubisco酶固有缺陷的严重制约——该酶不仅催化速率缓慢（k_cat^c仅为2-5 s^-1），还对O₂具有竞争性亲和力，导致光呼吸作用造成大量能量浪费和碳损失。自然界中，藻类蛋白核和蓝细菌羧酶体等二氧化碳浓缩机制(CCM)能通过区室化作用显著提升Rubisco周围的CO₂浓度，然而将这些复杂系统导入植物面临巨大技术障碍。

针对这一挑战，悉尼大学和澳大利亚国立大学的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项突破性研究，提出了一种基于细菌封装蛋白的模块化解决方案。该研究创新性地利用Quasibacillus thermotolerans来源的封装蛋白(QtEnc)作为纳米隔室支架，通过理性设计实现了多种Rubisco亚型的功能性封装，为构建人工二氧化碳浓缩机制开辟了新途径。

关键技术方法包括：通过Golden Gate克隆构建重组质粒系统；采用分阶段诱导表达策略优化蛋白质组装；利用蓝色原生电泳(BN-PAGE)和免疫印迹分析复合物形成；通过¹⁴C-羧基阿拉伯糖醇二磷酸(¹⁴CABP)结合实验定量活性酶含量；使用¹⁴CO₂固定测定法进行酶动力学分析；通过尺寸排阻色谱和阴离子交换色谱纯化纳米隔室；借助透射电子显微镜(TEM)表征结构完整性。

工程化Rubisco用于封装蛋白介导的区室化

研究人员选取了三种已知在E. coli和植物叶绿体中表达良好的Rubisco亚型：烟草(Nicotiana tabacum)的I型Rubisco、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的I型Rubisco以及深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)的II型Rubisco。基于结构功能考量，团队将14个氨基酸的QtEnc CLP标签（前接6个甘氨酸-丝氨酸柔性 linker）融合到RbcS亚基的C末端（针对I型酶）或RbcL的N/C末端（针对II型酶）。

CLP标记后Rubisco生物合成得以保留

天然PAGE和免疫印迹分析证实，CLP标记未影响Rubisco的正确组装。所有标记变体均形成预期的寡聚态结构（L₈S₈或L₂），仅RsRubisco的¹⁴CABP结合量降低28%。值得注意的是，烟草Rubisco在E. coli中的复杂组装过程（需7种额外叶绿体伴侣蛋白协同）未受CLP标记的显著影响。

CLP标记后Rubisco催化活性基本保持

动力学分析显示，CLP标记对大多数催化参数无显著影响。RsL₈S_c8、RrL₂和RrL_c2的k_cat^c、K_c(CO₂米氏常数)、K_o(O₂抑制常数)和K_RuBP均与未标记对照相当。唯一例外是NtRubisco的k_cat^c降低约两倍，这与其RbcS C末端结构敏感性相符。所有变体的CO₂/O₂特异性(S_c/o)均未改变。

CLP标记实现RsRubisco复合物的封装

共诱导表达实验中，CLP标记的RsL₈S_c8完全定位于~7.7 MDa的QtEnc区室，而未标记酶仍以游离形式存在。分阶段表达策略（先诱导Rubisco后诱导QtEnc）进一步确保功能复合物的定量封装。活性测定显示，分阶段样本的k_cat^c达到2.3 s^-1，相当于E. coli中未封装酶的60%，证明QtEnc天然孔道允许底物充分扩散。

分阶段表达对封装功能性RsL₈S₈ Rubisco至关重要

共诱导样本中检测到亚基化学计量失衡（RbcS_c过量）且无催化活性，表明封装物包含未组装亚基。而分阶段样本的亚基比例与天然酶一致，每个QtEnc区室平均封装约8个RsL₈S_c8全酶。此发现凸显了时序控制对多亚基酶功能性封装的关键作用。

功能性NtRubisco和RrRubisco也可在QtEnc内封装

分阶段表达同样成功封装了NtL₈S_c8（每个区室约7个全酶）。对于同源二聚体RrRubisco，C末端标记变体(RrL_c2)表现出更高封装效率（每个区室110个二聚体），且共诱导与分阶段表达效果相当，反映其简单结构对封装过程的适应性。

QtEnc超微结构和稳定性在Rubisco封装后得以保持

电镜分析显示所有Rubisco封装样本均保持完整二十面体结构。动态光散射(DLS)和差示扫描荧光法(DSF)证实封装未影响区室大小（直径42 nm）或热稳定性（熔解温度与空区室相当），表明Rubisco封装不损害QtEnc结构完整性。

Rubisco动力学参数反映底物可及性变化

封装酶均保留碳固定活性，但k_cat^c降低至多两倍。除RsRubisco外，其他变体的K_RuBP显著增加，提示RuBP扩散可能受限。相反，所有酶的K_c值未变，表明QtEnc孔道对CO₂具有充分渗透性。这一发现为后续孔道工程优化底物传输提供了方向。

本研究成功建立了基于QtEnc的模块化区室化平台，实现了多种Rubisco亚型的功能性封装。该系统的核心优势在于其遗传简洁性（单基因编码）和亚型无关的设计理念，克服了天然羧酶体对Rubisco结构的特异性要求。通过分阶段表达策略，研究人员解决了多亚基复合物组装与封装的协调问题，证实封装后酶活性得以保留且区室结构稳定。

尽管目前系统尚未整合碳酸酐酶(CA)以实现完整的CCM功能，但本研究为构建植物兼容型合成二氧化碳浓缩机制奠定了坚实基础。未来通过孔道工程优化底物传输、共封装碳酸酐酶和Rubisco活化酶，这一平台有望在C3作物中实现高效碳固定，为应对全球粮食安全挑战提供创新解决方案。该研究成果展示了合成生物学在重构植物代谢途径方面的巨大潜力，为作物光合效率的工程化改良开辟了新范式。