膜介导策略：生物制剂高效细胞内递送的新前沿

《Methods》：Membrane-mediated strategies for efficient intracellular delivery of biologics

本文综述了膜基载体在生物制剂细胞内递送中的应用，重点探讨了细胞来源囊泡和人工膜载体在克服生物制剂膜通透性差这一关键瓶颈方面的最新进展，为开发靶向细胞内靶点的新型疗法提供了重要策略。

　　

在人类疾病治疗领域，小分子化合物长期以来占据主导地位，约80%的已批准药物属于此类。这些化合物能够穿过细胞膜抑制细胞内靶点，但其疗效往往依赖于苛刻的条件，如需要深疏水口袋以实现强结合。更重要的是，小分子药物通常特异性较低且肾脏清除率高，其相对简单的结合依赖性作用机制难以解决如基因修饰等根本性疾病致病因素。

相比之下，生物制剂——包括多肽、抗体和遗传物质——具有更少的结合要求，能够靶向传统上被认为"不可成药"的蛋白质靶点，并实现如基因编辑等小分子药物无法实现的治疗方式。然而，生物制剂的高水溶性和大分子量导致其膜通透性极低，这严重限制了它们的作用靶点仅限于细胞外实体。值得注意的是，细胞内蛋白质和核酸靶点的数量是细胞外靶点的四倍以上。因此，实现生物制剂的高效细胞内递送对于充分发挥其治疗潜力至关重要。

为了克服这一挑战，研究人员将目光投向了膜介导的递送策略。这类方法对 cargo（载荷）的分子量和理化性质依赖性较低，展现出广阔的应用前景。COVID-19 mRNA 疫苗的成功就是一个典型案例，其中脂质纳米粒(Lipid Nanoparticles, LNPs) 对于保护并递送 mRNA 起到了关键作用。发表在《Methods》上的这篇综述文章系统探讨了基于膜的系统在改善生物制剂细胞内递送方面的应用，重点关注了膜的特性、类型、生产方法以及具体应用实例。

研究人员主要运用了以下几类关键技术方法：1) 天然膜载体的制备与工程化，包括细菌胞外囊泡、哺乳动物外泌体以及包膜病毒样颗粒(enveloped Virus-Like Particles, eVLPs) 的生成策略（如遗传修饰、培养条件优化等）；2) 合成膜载体的构建，特别是脂质体(Liposomes) 和脂质纳米粒(LNPs) 的制备技术（如薄膜水化法、溶剂注入法、微流控技术等）；3) 针对不同 cargo（如核酸、蛋白质）的载体功能化策略，包括靶向配体修饰、膜融合蛋白工程化等。

2. 膜基载体的生产方法

2.1. 天然来源的膜

2.1.1. 细菌胞外囊泡

细菌根据其膜形态和结构差异，通过不同机制产生囊泡。革兰氏阴性菌通过外膜出芽产生外膜囊泡(Outer Membrane Vesicles, OMVs)，或通过爆炸性细胞裂解产生爆炸性外膜囊泡(Explosive Outer-Membrane Vesicles, EOMVs) 和外-内膜囊泡(Outer-Inner Membrane Vesicles, OIMVs)。这些囊泡含有来自周质区和细胞质的生物分子。革兰氏阳性菌由于缺乏外膜，其囊泡生成被认为与细胞死亡相关的裂解机制类似。研究表明，通过遗传修饰（如 Tol-Pal 系统基因）或改变培养条件（如 pH、温度、化学刺激、抗生素处理）可显著提高细菌胞外囊泡(Bacterial Extracellular Vesicles, BEVs) 的产量。

2.1.2. 哺乳动物囊泡：外泌体/包膜 VLP

哺乳动物细胞产生外泌体(Exosomes)、微囊泡(Microvesicles) 和凋亡小体(Apoptotic Bodies) 等囊泡用于细胞间通讯。外泌体是其中最小的（30-200 nm）、形状标准的囊泡，其生成涉及内体形成、多泡体(Multivesicular Body, MVB) 成熟以及与质膜融合释放内部囊泡（即外泌体）的过程。通过基因操作（如过表达 STEAP3、syndecan-4 等）或环境刺激（如缺氧、细胞因子处理）可增强外泌体产生。包膜病毒样颗粒(enveloped VLPs, eVLPs) 是缺乏病毒遗传物质的非感染性颗粒，由 GAG 多蛋白和糖蛋白等病毒结构蛋白组装而成。它们可在昆虫或动物细胞中生产，并经过工程化改造用于递送基因或蛋白质。例如，基于 SARS-CoV-2 Spike 蛋白的工程化 eVLPs 能有效诱导中和抗体产生。

2.1.3. 外泌体和包膜 VPLs 在临床应用中的递送载体作用

外泌体易于获取但难以工程化，其 cargo 装载效率低。VLP 则能有效保护内部 cargo，并通过膜融合机制直接将其释放到细胞质中，避免内涵体/溶酶体降解。基于慢病毒或逆转录病毒的 VLP 载体已用于生成稳定细胞系。为了提高安全性，开发了不整合基因的递送方法，例如利用噬菌体 MS2 衣壳蛋白与 HIV GAG 融合的"输出器"(Exporter) 蛋白来特异性招募 cargo RNA。此外，利用人内源性逆转录病毒元件（如 PEG10 蛋白）产生的 eVLPs 可降低免疫原性。基于水泡性口炎病毒 G 糖蛋白(VSV-G) 的"gesicles" 可实现蛋白质的高效递送。在 CRISPR-Cas9 基因编辑领域，通过将 Cas9 或碱基编辑器与 GAG 多蛋白融合产生的 eVLPs，能够实现高效的靶向基因校正。

2.2. 合成膜

脂质体(Liposomes)

脂质体具有磷脂双分子层结构和水溶性核心，可根据结构分为单层囊泡(Unilamellar Vesicles, 包括 SUV, LUV, GUV)、寡层囊泡(Oligolamellar Vesicles, OLV) 和多层/多囊囊泡(Multilamellar Vesicles, MLV / Multivesicular Bodies)。其制备方法主要包括薄膜水化法（形成 MLV/MVB，再经均质化或挤出减小尺寸）和溶剂注入法（将脂质乙醇溶液与水溶液混合，自发形成 SUV）。微流控等技术有助于生产单分散性高的脂质体。

脂质纳米粒(Lipid Nanoparticles, LNPs)

LNPs 通常具有类似胶束的单层结构，主要成分包括磷脂、胆固醇、阳离子/可电离脂质以及 PEG 化脂质。阳离子/可电离脂质能有效负载带负电的核酸。LNP 的制备原理与脂质体类似，通常通过混合脂质乙醇溶液和酸性 cargo 水溶液实现。微流控技术是生产均一 LNPs 的常用方法。

3. 基于 LNP 的生物制剂细胞内递送

3.1. 核酸 cargo

小干扰 RNA(siRNA) 可诱导 RNA 干扰(RNAi)，但因其分子量大、负电荷强，需要载体协助细胞内递送。首个 FDA 批准的 siRNA 疗法药物 Patisiran (Onpattro) 即采用 LNP 递送，其关键成分包括可电离脂质 DLin-MC3-DMA (MC3)。DNA 疫苗稳定性好，可实现长效蛋白表达，LNP 递送 DNA 疫苗能靶向免疫器官并有效激发免疫反应。mRNA 疫苗则能快速产生大量抗原蛋白，无基因组整合风险，半衰期短。辉瑞-BioNTech 的 BNT162b2 和 Moderna 的 mRNA-1273 等 COVID-19 mRNA 疫苗均使用 LNP 递送 mRNA。自扩增 mRNA(self-amplifying messenger RNA, sa-mRNA) 疫苗（如 ARCT-154）利用病毒复制机制，能以更低剂量诱导强免疫反应。此外，靶向 T 细胞的 LNP（如表面功能化抗 CD5 抗体）可递送嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor, CAR) 编码 mRNA，为体内 CAR-T 疗法提供了新思路。

3.2. 蛋白质 cargo

抗体和蛋白质结合剂具有高特异性和强亲和力，但其细胞内递送效率低。通过蛋白质工程手段，例如在靶向 RAS 癌蛋白的 DARPin 结合剂 K27 的 C 端融合带负电的多聚天冬氨酸序列，可利用 LNP 的阳离子脂质实现高效装载和细胞内递送，从而抑制癌细胞生长。靶向 binder 与 E3 连接酶融合形成的生物蛋白降解靶向嵌合体(bioPROTACs) 也可通过类似策略递送，实现靶蛋白降解。CRISPR-Cas9 核糖核蛋白(Ribonucleoprotein, RNP) 的 LNP 递送是基因编辑领域的另一重要方向。研究发现，在中性 pH 下制备的 RNP-LNP 能有效进行基因编辑。通过优化脂质组成（如提高 DOTAP 比例）可改变 LNP 的器官靶向性（如从肝脏转向肺部）。相较于常用的 SpCas9，来自嗜热脂肪地芽孢杆菌的 GeoCas9 具有更高的稳定性，其进化版本 iGeoCas9 通过 LNP 递送显示出更高的编辑效率和同源定向修复(Homology-Directed Repair, HDR) 能力。

4. 结论

该综述指出，基于膜的递送策略能同时提高生物制剂的稳定性和细胞内递送效率。天然膜载体允许 cargo 与载体同步生产，但标准化难度大，对生物技术要求高。人工膜载体免疫原性低、感染风险小，且在 cargo 模态多样性和靶向性方面潜力巨大，但其脂质成分可能干扰细胞膜，表面修饰（如 PEG 化）可能引起炎症反应和组织损伤。当前研究重点在于增强靶向特异性同时降低免疫原性，例如通过靶向配体（肽、抗体）修饰 LNP 表面以实现向目标器官的递送重定向，以及开发新型脂质材料（如 pH 响应聚合物、仿生脂质、可生物降解脂质）。未来的发展方向包括开发精确靶向策略、确保低免疫原性以支持重复给药、建立可扩展的制造和稳健的质量控制体系。更安全、可控的膜基药物递送系统的进步，将为之前无法实现的创新疗法开辟道路。