通过经济高效的SCXG-MiXBM亲和系统实现食品蛋白质的可持续生物制造

《Journal of Cleaner Production》：Sustainable biomanufacturing of food proteins enabled by economical SCXG- MiXBM affinity system

本研究开发了一种基于食品级xanthan（XG）水凝胶和特异性蛋白标签MiXBM的新型环保亲和层析系统，通过生物矿化与离子交联制备的SCXG微球在13.21 mg/g吸附容量下实现>92%的纯度回收，较传统Ni-NTA系统降低99.8%耗材成本并符合食品安全标准。

　　

刘伟明|孙新鹏|顾金云|陈春树|钟乐|余志敏|杨帆

大连理工大学生物工程学院，中国大连甘井子区，116034

摘要

在食品生物技术中，可扩展的重组蛋白纯化仍受到环境可持续性、食品安全以及传统树脂高成本的限制。本研究建立了一种环保的亲和层析系统，使用食品级黄原胶（XG）水凝胶作为固定相，并结合高亲和力的MiXBM标签，有效消除了对有毒试剂的需求。通过仿生矿化和离子交联技术制备了海藻酸钠-CaCO₃-XG（SCXG）微球，这种可持续策略产生了具有增强亲水性的均匀多孔基质。综合表征验证了SCXG对MiXBM标记的GFP融合蛋白的结合能力（13.21 mg/g）。优化后的方案使标记蛋白和未标记蛋白的纯度均超过了92%。通过β-半乳糖苷酶的纯化和无乳糖牛奶的生产，证明了该平台的工业可行性。该平台的回收效率与IMAC（Ni-NTA）相当（约47%），但消耗成本降低了99.8%。重要的是，SCXG-MiXBM符合食品级标准，并展现出更优的环保指标（GREEN MOTION评分更高，E因子更低）。这项工作确立了SCXG-MiXBM作为一种能够协调环境可持续性、安全性和经济可行性的技术。

引言

在食品工业中，重组蛋白的纯化对于高附加值蛋白产品的设计、新型食品的开发以及精准营养的推进至关重要（Cui等人，2022；刘福等人，2022；Pereira等人，2025；吴等人，2025）。由于其选择性和操作效率，亲和层析成为主要的纯化策略（Arora等人，2017；Gomari等人，2020；Pina等人，2014）。该技术依赖于蛋白标签与固定化配体之间的特异性相互作用，从而从粗提物中捕获目标蛋白（Gomari等人，2020）。传统的系统如带有聚组氨酸标签的固定化金属亲和层析（IMAC）（Khan等人，2006）、谷胱甘肽S-转移酶和麦芽糖结合蛋白方法（Esposito和Chatterjee，2006；Thi等人，2024）存在显著局限性：（1）在填料合成中使用有害试剂（包括环氧溴丙烷和硫酸镍）违背了环境可持续性原则（Demir等人，2005；Kroviarski等人，1993；Hochuli等人，1987；Verhaar等人，1992）；（2）某些系统（如IMAC）由于使用咪唑和金属离子的浸出可能会影响食品安全（Gomari等人，2020；Wong等人，1991）；（3）商业树脂价格昂贵（100-500美元/克），限制了大规模应用（Li等人，2016；Thi等人，2024）。因此，构建一种新的纯化平台迫在眉睫。

基于多糖的水凝胶因其固有的多孔性、亲水性、食品安全性和成本效益而被认为是有前景的蛋白纯化材料（Gao等人，2023；Lee等人，2021；Lin等人，2022；Sharma等人，2020；Tian等人，2021；Zhao等人，2021）。最近的研究报道了几种蛋白纯化系统，例如用于免疫球蛋白G纯化的海藻酸盐-蛋白冷冻凝胶基质、用于溶菌酶分离的纤维素-海藻酸盐复合材料、用于木聚糖酶纯化的钙螯合曲拉兰基凝胶以及用于成功纯化牛血清白蛋白的钙海藻酸盐基凝胶膜（Sharma等人，2020；Tian等人，2021；Gao等人，2023；Zhang等人，2021，Zhang等人，2021）。然而，这些策略依赖于特定蛋白与多糖之间的非特异性吸附，导致蛋白纯化时的特异性较低，且适用范围有限。

黄原胶（XG）作为一种阴离子杂多糖，在食品工业和制药工程中具有广泛的应用性（Nsengiyumva和Alexandridis，2022）。其生物相容性、成本效益和凝胶形成能力使其成为工业上可行的层析树脂（Koyuncu等人，2022；Li等人，2023；Rashidi等人，2023；Riaz等人，2021；Zhang等人，2019）。此外，我们实验室之前发现了一个16 kDa的碳水化合物结合模块MiXBM（PDB ID：7EHG），它对XG基序具有很强的结合亲和力（解离常数KD = 7.16 × 10^?13 M）（Yang等人，2014；Wang等人，2025）。同时，MiXBM不会与其他多糖结合（Wang等人，2025）。因此，我们假设基于XG的水凝胶和MiXBM的目标特异性之间的正交协同作用可以为食品级蛋白纯化提供一种可行的解决方案。

为了解决食品工业蛋白纯化系统中环境可持续性、食品安全性和经济可行性的多重挑战，本研究开创了一种基于XG-MiXBM强相互作用机制的新亲和层析平台。通过结合仿生矿化和离子交联的集成方法固定了XG（Li等人，2019；Xu等人，2018）。这种环境可持续的策略促进了低成本且食品安全的海藻酸钠-CaCO₃-XG（SCXG）水凝胶微球的合成。综合表征证实了该系统在符合食品级标准的情况下能够高效分离标记蛋白和未标记蛋白。比较分析显示，SCXG-MiXBM在产品纯度、消耗成本降低、安全性提升和环境指标改善方面优于Ni-NTA-His₆系统，使其成为可持续重组蛋白生产的变革性解决方案。

材料、菌株和克隆

黄原胶（XG）购自中国北京的Solarbio Science & Technology Co., Ltd。海藻酸钠购自中国天津的Berens Biotechnology Co., Ltd。DNA聚合酶由中国大连的Takara Biomedical Technology Co., Ltd.提供。商业用的Ni-NTA-Sepharose、酵母提取物和胰蛋白胨由美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Fisher Scientific Inc.提供。所有其他化学品均为分析级，购自中国天津的Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd。

作为亲和层析树脂的XG固定化水凝胶微球

在本研究中，基于黄原胶（XG）的水凝胶被研究作为开发低成本、食品安全和可持续亲和基质的有希望的候选材料。先前的研究表明，碳水化合物结合模块MiXBM对XG具有高亲和力和特异性（Wang等人，2025）。因此，这两种生物大分子分别被选为亲和标签和固定相材料。为了开发一种新的XG固定化亲和基质，进行了相关研究。

结论

本研究开发了一种新的蛋白亲和层析系统（SCXG-MiXBM），利用MiXBM与XG之间的高结合亲和力和特异性。通过使用成本效益高的原材料和环保的方法制备了SCXG水凝胶微球，证明了其对MiXBM标记融合蛋白的有效吸附能力（13.21 mg/g）。该系统实现了高纯度回收（>92%），其效率与商业IMAC相当。

CRediT作者贡献声明

刘伟明：撰写——原始草稿、验证、方法学、实验设计。孙新鹏：撰写——审阅与编辑、可视化、实验设计。顾金云：数据分析。陈春树：验证。钟乐：资源协调。余志敏：撰写——审阅与编辑、监督、数据分析。杨帆：监督、资源协调、方法学设计、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

感谢中国国家自然科学基金（32072160、31671796、31801469）、辽宁省自然科学基金（J2020041、2020-MS-276、JYTZD2023029、20180550668）、辽宁省科技厅科研经费（2021-BS-226）、大连理工大学百千万人才计划和研究生创新基金的支持。