通过位点特异性VHH抗体结合增强活细胞的抗原识别能力

《ChemBioChem》：Enhancing Antigen Recognition of Living Cells by Site-Specific VHH Antibody Conjugation

本研究通过在抗mCherry VHH的C-末端引入非天然氨基酸AzF，实现定向固定，并利用点击化学将修饰后的VHH共价结合至DBCO涂层玻璃表面。实验证明，定向固定的VHH显著增强了对表达mCherry的HeLa细胞的特异性吸附，而未修饰的VHH或普通HeLa细胞未显示显著吸附。该技术为开发高特异性细胞微阵列和生物传感器提供了新方法。

　　近年来，生物传感器和微设备在细胞应用领域取得了显著进展，其性能和功能在许多方面超越了基于分子的传统传感器。这种技术的核心在于利用活细胞来实现更精确的功能检测，从而在细胞信号传导、组织工程、药物筛选和毒性评估等研究中展现出独特的价值。同时，这类设备也为开发更精准的生物传感器和微阵列系统提供了可能性。然而，将活细胞固定在设备表面，尤其是在芯片或电极上，仍然是一个技术难点。此外，许多传感器和微设备需要特定的细胞排列，如细胞阵列，这对细胞固定方法提出了更高的要求。因此，研究者们探索了多种策略来实现细胞的定向和高效固定，包括共价结合、生物相容性材料包裹、物理吸附以及通过抗原-抗体相互作用实现的细胞捕获。其中，抗体固定在细胞捕获过程中的作用尤为关键，因为它能够提供无标记、高选择性的细胞固定方式，特别是在处理细胞混合物时具有明显优势。

在抗体固定过程中，传统方法往往导致抗原结合位点的暴露不足，从而降低其识别效率。而定向固定则能够最大化抗体活性区域的可及性和亲和力，提升细胞捕获的效果。尽管定向固定的重要性已被广泛认可，但在实际操作中，如何实现可控的定向固定仍然是一个挑战。抗体分子本身含有多种反应性基团，这使得定向固定过程复杂化。为此，研究者们开发了多种策略，包括非共价结合如利用蛋白G捕捉抗体尾部、共价结合如靶向抗体Fc区域的糖链、以及利用蛋白His标签进行反应等。然而，这些方法在某些应用场景下存在局限性，特别是在处理像VHH这样的重链抗体片段时。VHH具有结构简单、分子量小、稳定性高、易筛选和表达等优点，同时还能保持与传统全长单克隆抗体或单链可变片段（scFv）相当的结合能力和特异性。然而，由于VHH缺乏Fc区域和二硫键，传统用于抗体固定的方法难以直接应用于VHH。因此，寻找一种能够实现VHH定向固定的创新方法成为当前研究的重点。

为了克服这一挑战，研究人员采用了一种新的策略，即通过引入非天然氨基酸，实现抗体的定点修饰。具体来说，将含有叠氮基团的非天然氨基酸——azido-phenylalanine（AzF）——定点插入到VHH的C端，远离其抗原识别位点。这样不仅保留了VHH的抗原结合能力，还使得其能够通过点击化学反应（click chemistry）与DBCO（dibenzylcyclooctyne）修饰的玻璃表面进行特异性结合。点击化学因其高度特异性、无副反应和可预测性，成为实现抗体定向固定的一种理想手段。通过这种方法，VHH-AzF能够在玻璃表面形成定向排列，从而增强其对特定抗原的识别能力。这一策略的优势在于，它避免了非天然氨基酸对抗体天然功能的干扰，同时还能在保持抗体活性的前提下，实现其在特定位置的固定。

在本研究中，研究人员成功表达了并纯化了针对mCherry的VHH（重链抗体的可变域），并在其C端引入了AzF。通过点击化学反应，这些VHH-AzF被固定在DBCO修饰的玻璃表面。随后，研究人员将表达mCherry的HeLa细胞（mCherry-HeLa细胞）与普通HeLa细胞分别置于该玻璃表面，观察其固定情况。结果表明，mCherry-HeLa细胞能够有效固定在VHH-AzF修饰的玻璃上，而普通HeLa细胞则无法附着。这说明，通过定向固定VHH，可以实现对特定细胞类型的高效捕获。同时，研究还验证了该方法在抗原-抗体识别中的特异性，即在混合抗原溶液中，只有与相应VHH结合的抗原能够被有效捕获。这一发现不仅证明了该方法在细胞固定方面的可行性，也为开发更精准的生物传感器和微阵列系统提供了理论和技术支持。

在实验过程中，研究人员首先对玻璃表面进行了处理，以确保其能够有效结合DBCO修饰的VHH-AzF。通过一系列化学反应，包括碱性溶液清洗、piranha溶液处理、硅烷溶液反应以及最终的DBCO-COOH和DMTMM修饰，研究人员成功构建了一个适合VHH-AzF结合的玻璃表面。为了验证DBCO修饰的成功，研究人员将Texas-RED-PEG3-Azide与玻璃表面反应，并通过荧光显微镜观察其结合效果。结果显示，DBCO修饰的玻璃表面能够与Texas-RED-PEG3-Azide发生反应，产生明显的荧光信号，而未修饰的玻璃则没有类似的反应。这表明，玻璃表面成功引入了DBCO基团，为后续的VHH-AzF固定奠定了基础。

接下来，研究人员对VHH-AzF的表达和纯化进行了详细分析。通过电泳分析，他们确认了VHH-AzF的分子量约为16 kDa，与预期相符。同时，通过与DBCO-FAM的反应，进一步验证了VHH-AzF中AzF基团的活性。结果显示，VHH-AzF能够与DBCO-FAM发生特异性结合，而未修饰的VHH则没有类似的反应。这说明，AzF的引入并未影响VHH的结构和功能，同时保留了其与DBCO的反应能力。为了进一步评估VHH-AzF的抗原结合能力，研究人员使用了ELISA方法，测定了其与mCherry的结合亲和力。实验结果表明，VHH-AzF能够以浓度依赖的方式与mCherry发生高亲和力结合，其解离常数（KD）为9 nm，显示出极高的结合效率。这一结果为后续的细胞固定实验提供了坚实的理论依据。

在细胞固定实验中，研究人员将mCherry-HeLa细胞和普通HeLa细胞分别与VHH-AzF修饰的玻璃表面进行孵育。结果显示，随着时间的推移，mCherry-HeLa细胞的附着数量显著增加，而在相同时间内，普通HeLa细胞的附着数量几乎没有变化。这表明，VHH-AzF修饰的玻璃表面能够有效识别并捕获表达mCherry的细胞，而对未表达该蛋白的细胞则没有吸引力。此外，研究还考察了不同浓度对细胞附着的影响，发现当细胞浓度达到1×106 cells/mL时，mCherry-HeLa细胞的附着数量趋于稳定，而超过这一浓度后，附着效果并未显著提升。这说明该方法在细胞固定过程中具有一定的饱和性，且在较低浓度下即可实现高效的细胞捕获。

为了进一步验证该方法的适用性，研究人员还测试了VHH-AzF对其他抗原（如EmGFP）的识别能力。通过将EmGFP与VHH-AzF修饰的玻璃表面进行反应，研究人员发现，只有与相应VHH结合的抗原能够被有效捕获，而其他抗原则没有明显的结合信号。这表明，该方法不仅适用于mCherry的捕获，也适用于其他类似抗原的识别，显示出其广泛的适用性。此外，研究还对比了不同固定策略对细胞附着的影响，发现通过定点修饰VHH并结合DBCO修饰的玻璃表面，能够显著提高细胞的固定效率，相较于传统的随机固定方法，具有更高的特异性和灵敏度。

从更广泛的角度来看，这一研究不仅为生物传感器和微阵列系统的开发提供了新的思路，也为细胞生物学研究提供了强有力的工具。通过定向固定VHH，研究人员能够在特定区域捕获特定类型的细胞，从而实现对细胞行为的精准控制。例如，在药物筛选和毒性评估中，这种定向固定技术可以用于快速检测细胞对不同化合物的反应，提高实验的效率和准确性。此外，该方法还可以用于监测细胞在特定环境下的行为变化，如细胞在药物处理后的磷酸化状态，为细胞功能研究提供了新的可能性。

本研究的创新点在于，通过引入非天然氨基酸AzF，实现了VHH的定点修饰，从而克服了传统抗体固定方法的局限性。这一方法不仅保留了VHH的高亲和力和特异性，还通过点击化学反应实现了其在玻璃表面的定向固定。这种定向固定策略能够有效提高细胞捕获的效率和选择性，为开发更高效的生物传感器和微阵列系统提供了理论和技术支持。同时，该方法也适用于其他类型的细胞和抗原，显示出其广泛的适用性。

值得注意的是，尽管该方法在实验中表现出色，但在实际应用中仍需进一步优化。例如，如何在不同类型的细胞和抗原中保持相同的固定效率，以及如何在大规模生产中实现该方法的稳定性，都是未来研究需要解决的问题。此外，研究人员还需要探索该方法在不同环境下的适用性，如在体外实验和体内实验中的表现差异。这些研究将进一步推动该技术在生物医学和生物工程领域的应用。

总的来说，这项研究展示了通过定点修饰VHH并结合点击化学反应实现细胞定向固定的有效性。该方法不仅提高了细胞捕获的效率和选择性，还为开发更精准的生物传感器和微阵列系统提供了新的可能性。随着技术的不断进步，这种定向固定策略有望在更多领域得到应用，包括细胞信号传导研究、组织工程、药物筛选以及生物医学检测等。未来，研究者们可以进一步拓展这一方法，将其应用于更复杂的细胞系统和更广泛的生物医学应用中。