单细胞空间转录组图谱揭示多发性硬化慢性活动性病灶中CD8+ T细胞-脂质相关小胶质细胞致病性炎症微环境

《Immunity》：Single-cell spatial transcriptomic profiling defines a pathogenic inflammatory niche in chronic active multiple sclerosis lesions

本研究针对多发性硬化（MS）进展中区室化炎症的持续机制这一关键难题，通过整合单核RNA测序（snRNA-seq）与多重误差稳健荧光原位杂交（MERFISH）技术，构建了慢性活动性MS病灶的高分辨率空间单细胞图谱。研究发现病灶边缘存在CD8+ T细胞富集的微环境，其与呈现干扰素应答和脂质代谢紊乱的GPNMB+炎症小胶质细胞（MIMS2）密切互作。机制上，干扰素-γ（IFN-γ）通过抑制胆固醇转运蛋白ABCA1/ABCG1介导的胆固醇外流，促使小胶质细胞储存髓鞘来源的胆固醇，形成脂质 laden的泡沫样状态。在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中，基因敲除小胶质细胞Abca1/Abcg1加剧了泡沫样小胶质细胞的形成及炎症反应，而药物抑制DHCR24可促进胆固醇外流、缓解疾病严重程度。该研究首次在空间层面揭示了CD8+ T细胞与脂质代谢失调的小胶质细胞之间的恶性循环是驱动MS慢性炎症的关键环节，为靶向脂质代谢治疗进展性MS提供了新策略。

　　

在神经科学领域，多发性硬化（Multiple Sclerosis, MS）一直是一个令人困惑的难题。这种免疫介导的中枢神经系统疾病，其最棘手之处在于，即使使用高效免疫疗法成功控制了急性复发，许多患者的病情仍会不可阻挡地走向进展阶段。这背后隐藏的推手，正是大脑内持续“阴燃”的慢性炎症。而慢性活动性MS病灶，作为这种非缓解性炎症的典型标志，其特征是脱髓鞘的核心区域被一圈 chronically activated 的小胶质细胞所包围，如同火山口边缘的余烬，持续释放破坏性能量。然而，究竟是什么机制维持着这种区室化炎症的持久不愈？细胞间复杂的相互作用网络又是如何构成的？这些问题长期以来缺乏高分辨率的答案。

为了揭开这个谜团，由Ruoqing Feng、Lena Spieth、Lu Liu等共同领导的研究团队在《Immunity》杂志上发表了他们的最新成果。他们意识到，传统的转录组学技术虽然能识别细胞类型，却无法揭示细胞在组织原位的空间位置和微环境信息。而慢性炎症的本质恰恰依赖于特定细胞在特定位置的相互作用。因此，研究人员决定采用一种多模态研究策略，将单核RNA测序（snRNA-seq）与新兴的多重误差稳健荧光原位杂交（MERFISH）技术相结合，对经神经病理学鉴定为慢性活动性的MS病灶进行高精度、空间分辨的单细胞转录组分析。

本研究的技术核心在于其多模态整合分析策略。研究人员首先从荷兰脑库获取了经病理确认的慢性活动性MS患者及健康对照的冻存脑组织样本。通过结合组织病理学免疫组化（如MOG、MHC-II染色）进行样本筛选和定位。关键的技术创新在于同时对该组织进行单核RNA测序（snRNA-seq）和基于500个基因panel的多重误差稳健荧光原位杂交（MERFISH）空间转录组成像。利用BANKSY算法进行半监督空间域分割，识别出不同的病灶区域（如富白细胞脱髓鞘白质LR DMWM、贫白细胞脱髓鞘白质LP DMWM、病灶边缘和病灶周围白质PLWM）。进一步通过CytoSPACE工具将snRNA-seq数据与MERFISH空间数据进行整合，实现基因表达的跨模态互补。在功能验证层面，研究采用了原代小胶质细胞培养、实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型（包括小胶质细胞特异性Abca1/Abcg1条件性敲除小鼠）、流式细胞术、免疫荧光、电子显微镜、RNAscope原位杂交以及脂质组学分析等多种技术手段。

空间分辨的单细胞转录组表征慢性活动性MS病灶

研究人员对来自MS捐赠者的冷冻脑样本进行了组织病理学分析，重点评估了病灶的脱髓鞘程度、病灶边缘激活的髓系细胞积累以及T细胞浸润情况，最终筛选出14个慢性活动性病灶用于高分辨率转录组分析。通过MERFISH技术，他们成功获取了401,794个细胞的转录本，并鉴定出7种主要细胞类型。利用BANKSY进行空间域分割，不仅成功区分了灰质和白质区域，还识别出脱髓鞘白质（DMWM）域以及一个与血管和免疫细胞富集相关的域，很可能代表了脱髓鞘病灶相关的血管周围免疫细胞集合。分析表明白质区域内，与病灶周围白质（PLWM）和健康白质相比，MS患者的LR DMWM域中少突胶质细胞显著减少，而星形胶质细胞、小胶质细胞/巨噬细胞、淋巴细胞和血管细胞明显增多。

不同的反应性胶质细胞状态定义了慢性活动性MS的病灶域

通过对少突胶质细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞进行亚群分析，研究揭示了多种成熟稳态和反应性胶质细胞状态，包括应激和疾病相关少突胶质细胞（STROLs和DAOLs）、MS相关炎症小胶质细胞（MIMS）和MS相关炎症星形胶质细胞（AIMS）。利用SPATA2梯度映射，研究团队在DMWM和PLWM之间界定了一个边缘域（rim domain），该域具有高细胞密度、少突胶质细胞逐渐减少、特定反应性胶质细胞状态扩增以及邻近局部细胞相似性降低等特点。在DMWM内，残存的少突胶质细胞主要处于STROL和DAOL状态，而小胶质细胞和星形胶质细胞则富集，部分恢复到稳态，部分主要表现为MIMS3和AIMS4状态。在慢性活动性病灶边缘，STROL和DAOL状态最为突出，同时伴有激活的MIMS和AIMS状态，特别是MIMS2和MIMS3以及AIMS1-AIMS3。通路富集分析显示，与DMWM相关的胶质细胞亚群中上调的基因与氧化应激和神经变性通路相关，而病灶边缘的则与炎症过程、脂质代谢和IFN/细胞因子信号传导相关。这些发现强调了不同的反应性胶质细胞状态定义了病灶域，并将边缘视为炎症活动的焦点。

CD8⁺ T细胞与慢性活动性病灶边缘的IFN应答小胶质细胞相关联，导致脂质代谢受损

研究发现，浸润的外周免疫细胞，包括单核来源的巨噬细胞、T细胞、自然杀伤（NK）细胞以及B细胞，在MS病灶中均有存在。其中，巨噬细胞、T细胞和B细胞在DMWM和/或边缘域显著积累。CD8⁺ T细胞是主要的淋巴细胞群体，在病灶边缘富集，其分布与炎症性和IFN应答性胶质细胞状态的分布平行。通过聚类分析，研究人员确定了六个不同的T细胞微环境（niche），其中T2代表了位于病灶边缘的T细胞微环境。邻域分析发现，T2 T细胞微环境周围的细胞群落中GPNMB转录本显著富集，提示T细胞与MIMS2之间存在局部相互作用。CellChat分析预测，在DMWM和病灶边缘，反应性胶质细胞与CD8⁺ T细胞之间存在强烈的相互作用权重，而MIMS2显示出与CD8⁺ T细胞最高的通讯概率。

免疫荧光验证证实了GPNMB⁺小胶质细胞（MIMS2）在病灶边缘的积累，而FTH1⁺小胶质细胞（MIMS3）在病灶边缘和DMWM中均相对增加。重要的是，CD8⁺ T细胞在病灶边缘高度富集，并且经常与GPNMB⁺小胶质细胞密切关联。转录组分析显示MS样本中的CD8⁺ T细胞IFNG表达升高，其邻近细胞（尤其是病灶边缘）显示出更高的IFN应答评分。蛋白水平检测发现，在GPNMB⁺细胞与CD8⁺ T细胞邻近的区域，STAT1反应性在DMWM和病灶边缘均增加，表明IFN信号通路激活。

为了探究IFN信号与小胶质细胞脂质代谢之间的机制联系，研究人员利用小鼠原代小胶质细胞进行培养实验。发现IFN-γ处理增强了髓鞘摄取诱导的PLIN2⁺脂滴形成，并转录水平上降低了胆固醇转运蛋白Abca1的表达，同时增强了Abcg1和Cxcl10的表达。通过MERFISH对培养的小胶质细胞进行单细胞分析，聚类出三种不同的激活状态。其中，MG2和MG3状态富集了与胆固醇储存、合成和炎症相关的基因，而下调了胆固醇外排的标记基因。这两个状态在IFN-γ处理的培养物中积累，并且富含IFN刺激基因。功能实验表明，IFN-γ显著抑制了小胶质细胞的胆固醇外流，而LXR激动剂GW3965则能促进外流。固醇组学分析进一步证实，IFN-γ处理单独即可显著降低胆固醇外流，而不改变游离胆固醇的浓度。这些结果表明，IFN-γ（可能由T细胞分泌）可能促进髓鞘源性胆固醇在小胶质细胞中的储存并抑制其外流，使其陷入脂质 laden 的状态。

小胶质细胞中功能失调的脂质循环加剧炎症性脱髓鞘

为了研究脂质 laden 的泡沫样小胶质细胞在炎症中的作用，研究人员在Cx3cr1-CreERT2 Abca1/Abcg1^flox/flox小鼠中条件性敲除了小胶质细胞的ABCA1和ABCG1，以损害胆固醇外流。在诱导MOG_35-55 EAE后，阻断小胶质细胞胆固醇外排导致了更高的EAE疾病严重程度和病变负荷，并伴有脊髓中T细胞募集的显著增加。免疫荧光和电镜分析揭示了更大且更分散的病变，以及IBA1⁺髓系细胞中GPNMB、PLIN2和STAT1表达的增加和脂滴的积累。对EAE小鼠脊髓小胶质细胞的scRNA-seq分析鉴定出几个不同的疾病相关小胶质细胞（DAM）状态，其中一个Gpnmb⁺簇富集了与脂质代谢相关的转录本。小胶质细胞ABCA1/G1的缺失导致EAE中Gpnmb⁺簇的增加。脂质组学分析显示，在小胶质细胞ABCA1/G1缺陷的背景下，EAE小鼠脊髓中胆固醇酯大量积累。CellChat分析表明，小胶质细胞中缺陷的胆固醇外流增强了与CD4⁺和CD8⁺ T细胞的相互作用。这些发现表明，小胶质细胞中缺陷的胆固醇外流加剧了与T细胞的炎症相互作用，可能导致更严重的疾病进程。

药物刺激脂质外流改善EAE

研究人员假设，靶向固醇代谢可能缓解泡沫样小胶质细胞的形成和炎症性脱髓鞘。他们使用了DHCR24抑制剂SH42，通过阻断desmosterol向胆固醇的转化，可能增加desmosterol水平，进而激活LXR信号通路，促进胆固醇外流。在EAE症状出现时开始给予SH42治疗，不仅降低了疾病严重程度，还导致病变体积变小、病变总数减少，同时减少了脊髓中髓系细胞和T细胞的积累。在体外，SH42处理原代小胶质细胞可增加desmosterol浓度并上调LXR靶基因Abca1的表达，刺激髓鞘处理后小胶质细胞的胆固醇外流。相应地，在SH42治疗的EAE小鼠脊髓中，观察到Abca1表达显著增加，同时IBA1⁺髓系细胞中GPNMB和PLIN2反应性降低。此外，在SH42治疗的一组早期EAE小鼠中，几个炎症转录本的表达降低。这些发现表明，增强脂质外流可以减少泡沫样小胶质细胞的形成和炎症活性。

本研究通过构建慢性活动性MS病灶的高分辨率空间单细胞图谱，揭示了CD8⁺组织驻留记忆T（T_RM）细胞与脂质代谢失调的GPNMB⁺小胶质细胞在病灶边缘形成的致病性炎症微环境是驱动MS慢性进展的关键环节。机制上，IFN-γ通过抑制ABCA1/G1介导的胆固醇外流，促使小胶质细胞储存髓鞘源性胆固醇，形成功能失调的泡沫样状态，进而放大与T细胞的炎症相互作用，形成恶性循环。功能实验证实，小胶质细胞特异性Abca1/Abcg1缺失加剧EAE，而药物干预固醇代谢（如DHCR24抑制剂SH42）则可促进胆固醇外流、缓解炎症。该研究不仅为理解MS区室化炎症的持续机制提供了前所未有的空间视角，更重要的是，将脂质代谢与免疫炎症巧妙地联系起来，提出了靶向小胶质细胞脂质处理功能以治疗进展性MS的新策略，为目前缺乏有效疗法的进展期MS患者带来了新的希望。