Crepidium calophyllum（兰科：Malaxidinae）的完整质体基因组及其系统发育分析

《Mitochondrial DNA Part B》：The complete plastid genome of Crepidium calophyllum (Orchidaceae: Malaxidinae) and phylogenetic analysis

C. calophyllum全基因组测序显示其拥有158,884bp的典型四区段叶绿体基因组，支持其从Malaxis属分出的系统发育地位，并揭示Malaxis和Liparis的多系群现象。

　　在热带森林中，中国南方和东南亚地区广泛分布着一种名为*Crepidium calophyllum*的陆生兰科植物。它曾被归类于*Malaxis*属，后经分类学修订被重新划入*Crepidium*属。这项研究首次提供了*C. calophyllum*的完整叶绿体基因组（plastome）信息，其长度为158,884个碱基对。研究发现，该物种的基因组成和排列顺序与Malaxidinae亚属内的其他自养植物高度一致。通过基于完整叶绿体基因组的系统发育分析，使用最大似然法和贝叶斯推断法，结果表明*C. calophyllum*在*Crepidium*属内，与*Dienia*属形成姐妹群关系。这一发现也揭示了*Malaxis*和*Liparis*属的多系性，暗示Malaxidinae亚属内部存在未解决的分类学问题。

*C. calophyllum*因其紧凑的生长形态、具有白色条纹的棕褐色叶片以及密集的顶端花序而受到关注。这些特征使其在园艺价值方面具有潜力，特别是在观赏性植物领域。此外，*Crepidium*属的植物被认为能够产生多种具有生物活性的化合物，包括抗氧化、抗炎和神经保护特性。虽然目前尚未有直接的生态数据，但对其他陆生兰科植物的研究表明，栖息地质量对兰科植物的多样性及种群存续具有重要影响。由于*C. calophyllum*依赖于森林下层的生态环境，因此需要引起保护重视。

尽管*C. calophyllum*在分类学上具有重要意义，但此前尚未有其完整的叶绿体基因组数据被报道。本研究通过Illumina测序平台获取了高质量的基因组数据，并使用NOVOPlasty v4.3.1软件进行组装。随后，通过Bowtie2 v2.3.5对测序数据进行比对，确认了基因组的重复区域和单拷贝区域边界。最终的平均测序覆盖度达到了623.2，为研究提供了坚实的基因组基础。

在基因组注释方面，研究采用Geneious Prime? v2023.0.1软件进行自动注释，并结合70%的相似性阈值。此外，对部分基因进行了手动校正，以确保准确性。tRNA基因的注释则使用tRNAscan-SE v2.0软件完成。为了更直观地展示基因组结构，研究还使用OGDRAW v1.3.1软件绘制了环状基因组图谱。该图谱清晰地展示了基因的分布、方向及功能分类，同时以灰度图的形式呈现了GC含量的分布情况，颜色越深表示GC含量越高。

研究发现，*C. calophyllum*的叶绿体基因组具有典型的四部分结构，包括一对重复区域（IRs）、一个大单拷贝区域（LSC）和一个小单拷贝区域（SSC）。该基因组包含133个基因，其中87个为蛋白质编码基因（PCGs），38个为转运RNA基因（tRNA），8个为核糖体RNA基因（rRNA）。其中，19个基因出现重复，包括7个PCGs（如*rpl2*、*rpl23*、*rps7*、*rps12*、*ndhB*、*rps19*和*ycf2*），8个tRNA基因（如*trnA-UGC*、*trnH-GUG*、*trnI-CAU*、*trnI-GAU*、*trnL-CAA*、*trnN-GUU*、*trnR-ACG*和*trnV-GAC*），以及全部4个rRNA基因（*rrn16S*、*rrn23S*、*rrn4.5S*和*rrn5S*）。其余基因则以单拷贝形式存在。大多数基因没有内含子，而10个PCGs和6个tRNA基因各包含一个内含子。其中，*matK*基因位于*trnK-UUU*内含子中，*rps12*基因则是一个转接基因，其5′端外显子位于LSC区域，而两个3′端外显子位于IR区域。这些基因的组成和排列顺序与*Crepidium*和*Malaxis*属的其他物种基本一致，同时也与典型的自养被子植物如烟草（*Nicotiana tabacum*）和拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）相似。

通过基于完整叶绿体基因组的系统发育分析，最大似然法（ML）和贝叶斯推断法（BI）构建的系统树呈现出一致的拓扑结构。研究发现，*C. calophyllum*被归入一个中度支持的分支中，该分支包括其他三个*Crepidium*属的叶绿体基因组，而*Dienia ophrydis*则被鉴定为与其最近的姐妹群。值得注意的是，两个已知的*Malaxis monophyllos*叶绿体基因组在系统树中出现了不一致的分布：一个与*Liparis*属的*petiolata*和*auriculata*物种形成集群，而另一个则被归入完全不同的分支，目前被列为NCBI上的参考基因组。此外，*Liparis*属的物种在系统树中被分散到多个分支，表明其具有多系性。这一结果与以往的研究一致，但也进一步支持了*Liparis*与*Dienia*、*Oberonioides*和*Stichorkis*等属之间的紧密系统发育关系，对当前的属级分类提出了质疑。

研究还指出，一些Malaxidinae亚属的属，如*Alatiliparis*、*Crossoglossa*、*Crossoliparis*、*Hammarbya*、*Hippeophyllum*、*Orestias*和*Tamayorkis*，目前尚未有完整的叶绿体基因组数据，甚至部分物种缺乏基本的分子数据，如ITS或条形码标记。因此，全面的基因组采样对于解决这些分类学不确定性至关重要。为了进一步验证系统发育关系，研究还采用了多个已知的叶绿体基因组作为参考，包括*Liparis*、*Oberonia*、*Stichorkis*等属的物种，以及作为外类群的*Dendrobium officinale*和*Bulbophyllum reptans*。这些数据的整合为系统发育分析提供了更全面的视角，有助于揭示不同物种之间的演化关系。

本研究通过比较*C. calophyllum*的叶绿体基因组结构，进一步支持了其当前的属级分类，并为Malaxidinae亚属的分类学问题提供了新的见解。虽然*C. calophyllum*的叶绿体基因组与*Crepidium*属的其他物种高度相似，但其系统发育分析结果也表明，*Malaxis*和*Liparis*这两个属可能并非单系。这一发现可能对兰科植物的系统分类产生深远影响，尤其是在Malaxidinae亚属内部，不同属之间的演化关系仍存在争议。此外，研究还发现，某些*Liparis*属的物种可能与*Crepidium*和*Dienia*形成更紧密的系统发育关系，而另一些则可能与*Malaxis*和*Oberonioides*更接近。这些结果表明，当前的属级分类可能需要重新审视。

从生态角度来看，*C. calophyllum*的生长依赖于森林下层的环境，这使其在生态系统中具有独特的生态角色。同时，由于其观赏价值和潜在的药用价值，该物种可能在园艺和生物资源利用方面具有重要应用前景。然而，目前对*C. calophyllum*的生态数据仍较为有限，需要进一步的野外调查和研究。此外，由于其在系统发育分析中表现出与其他*Crepidium*属物种的相似性，研究认为其在分类学上属于*Crepidium*属，并且这一结论得到了分子系统发育分析的支持。这些分析利用了核ITS和叶绿体*matK*标记，进一步验证了*Crepidium*和*Malaxis*属之间的分化。

本研究不仅提供了*C. calophyllum*的完整叶绿体基因组数据，还揭示了兰科植物在系统发育分析中的复杂性。通过整合多种分子标记和叶绿体基因组数据，研究为兰科植物的分类提供了新的证据，并为未来的分类学研究奠定了基础。同时，该研究也强调了生态和分类学之间可能存在的联系，即不同的生态适应性可能影响叶绿体基因组的稳定性。这一发现可能对兰科植物的进化研究具有重要意义，尤其是在探讨其适应森林下层环境的机制方面。

在数据共享方面，本研究的基因组数据已上传至NCBI的GenBank数据库，并获得公开访问权限。研究数据的访问编号为PV415188，相关生物项目编号为PRJNA1243755，生物样本编号为SAMN47628971，SRA编号为SRR32911739。这些数据的公开有助于其他研究人员进一步验证和扩展本研究的发现，同时也为兰科植物的分类和演化研究提供了宝贵的资源。

本研究的成果不仅有助于深入理解*C. calophyllum*的生物学特性，也为兰科植物的系统发育和分类学研究提供了新的视角。通过对叶绿体基因组的全面分析，研究揭示了不同属之间的演化关系，并为未来的分类学修订提供了依据。同时，研究还强调了全面的基因组采样在解决分类学不确定性中的重要性，特别是在缺乏分子数据的物种中。因此，未来的研究应加强对这些物种的基因组测序，以进一步明确其分类地位。

此外，本研究还涉及伦理审查问题。研究项目已通过韶关大学的伦理审查委员会批准，并遵守了中国关于科技伦理审查的相关规定。研究过程中未涉及人类受试者、动物或IUCN列出的濒危物种，所有材料均按照当地法规进行采集和处理，确保了研究的合法性。研究过程中还借助了ERNIE Bot（yiyan.baidu.com）进行英文语法和词汇的优化，以确保研究内容的准确性和专业性。研究作者对所有科学内容负有最终责任，确保研究的严谨性和科学性。

本研究的成果不仅在学术上具有重要意义，也在实际应用中具有潜在价值。通过对*C. calophyllum*的叶绿体基因组分析，研究揭示了其在系统发育和分类学上的独特性，同时也为兰科植物的分类和演化研究提供了新的证据。未来的研究应进一步探索*C. calophyllum*的生态适应机制，以及其在园艺和药用领域的应用潜力。此外，研究还强调了生态和分类学之间的潜在联系，即不同生态适应性可能影响基因组的结构和稳定性。这一发现可能对兰科植物的进化研究产生深远影响，特别是在探讨其适应森林下层环境的机制方面。

在数据可用性方面，本研究的所有基因组数据均以开放的方式提供，确保了研究的透明性和可重复性。这一做法不仅符合现代科学研究的开放标准，也为其他研究人员提供了进一步验证和扩展研究结果的机会。此外，研究还通过补充材料提供了详细的实验数据和分析过程，确保了研究的完整性和可信度。这些数据的共享有助于推动兰科植物的系统发育和分类学研究，促进科学界的进一步探讨和研究。

综上所述，本研究通过*C. calophyllum*的叶绿体基因组分析，不仅揭示了其在系统发育中的位置，也为兰科植物的分类学问题提供了新的证据。研究结果表明，*Malaxis*和*Liparis*这两个属可能并非单系，而*C. calophyllum*的系统发育关系更接近*Crepidium*属。这一发现可能对未来的分类学修订产生重要影响，尤其是在探讨兰科植物的演化关系和生态适应性方面。同时，研究还强调了全面的基因组采样在解决分类学不确定性中的重要性，为兰科植物的系统发育研究提供了新的方向和思路。