冷冻电镜揭示阿斯加德古菌染色质的开放与闭合双态组装及其镁离子调控机制

《Neuron》：Cryo-EM reveals open and closed Asgard chromatin assemblies

本研究通过冷冻电镜首次解析了阿斯加德古菌Hodarchaeales LC3组蛋白HHoB形成的染色质高级结构，发现其可组装为紧凑闭合态和延伸开放态两种超核小体构象。该研究证实闭合构象在古菌中保守存在，而开放构象为阿斯加德特有，且Mg2+浓度可动态调控两种状态的平衡，为理解真核生物染色质进化提供了关键结构证据。

　　

在生命演化的长河中，真核生物复杂性的起源始终是未解之谜。近年来，阿斯加德古菌（Asgard archaea）的发现为这一谜题提供了关键线索，因其被证实是真核生物在进化树上最亲近的古菌亲属。然而，作为遗传信息载体的染色质，其在这类关键古菌中的组织形式却一直笼罩在神秘之中。与真核生物高度保守的核小体（由H2A、H2B、H3、H4八聚体缠绕147 bp DNA）不同，大多数古菌的组蛋白能够形成同源或异源二聚体，组装成包裹约30 bp DNA的“核小体”，并进一步通过堆叠形成长度可变的“超核小体”（hypernucleosome）。此前，人们对古菌染色质的认知主要来源于广古菌门（Euryarchaeota）的模型物种，而对在进化上更具意义的阿斯加德古菌的染色质结构知之甚少。许多阿斯加德古菌编码多个组蛋白变体，其中一些甚至含有类似真核组蛋白的延伸尾巴，这暗示其染色质结构可能更为复杂和动态，或许隐藏着通向真核染色质的关键进化步骤。因此，揭示阿斯加德古菌染色质的精细结构，对于理解真核生物核小体的起源至关重要。

为了解开这一谜团，由Harsh M. Ranawat、Marc K. Cajili等人组成的研究团队在《Molecular Cell》上发表了他们的最新成果。他们聚焦于霍德古菌（Hodarchaeales）LC3基因组中编码的十个组蛋白之一——不含尾巴的短组蛋白HHoB，综合运用冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）、生物化学和生物物理学方法，首次在原子水平上揭示了阿斯加德古菌染色质的双态组装奥秘。

研究人员主要运用了以下几项关键技术：首先，他们利用冷冻电镜单颗粒分析技术，解析了HHoB与147 bp Widom601 DNA在不同镁离子（Mg²⁺）浓度下形成的复合物结构。其次，通过电泳迁移率变动分析（EMSA）和微量热泳动（MST）测定了HHoB与DNA的结合特性。再者，借助光学镊子力谱测量（Force Spectroscopy）和系留粒子运动（TPM）等单分子生物物理技术，定量研究了HHoB-DNA复合物在不同Mg²⁺条件下的机械性能和压缩状态。最后，通过定点突变和结构比对，深入探究了稳定不同构象的关键分子界面。

Asgard组蛋白HHoB在体外形成开放和闭合核小体

研究伊始，团队对LC3中的三个短组蛋白（HHoB, HHoF, HHoG）进行了初步生化分析。电泳迁移率变动分析显示，与广古菌组蛋白HMfB高度协同的结合模式（产生单一迁移条带）不同，这些阿斯加德组蛋白与DNA结合时呈现出梯状条带，表明其结合模式可能更具动态性或连续性。研究人员选择HHoB进行深入的结构研究。在含有1 mM Mg²⁺的缓冲液中重构HHoB核小体并进行冷冻电镜分析后，出乎意料地发现了两种截然不同的三维结构类别：一种是紧密的闭合构象，另一种是伸展的开放构象。这两种构象在数据集中的丰度相当。高分辨率结构（闭合态3.4 ?，开放态3.6 ?）显示，两种构象均由四个HHoB组蛋白二聚体包裹约120 bp的DNA，形成左手超螺旋。闭合构象与先前报道的HMfB核小体结构高度相似（Cα原子均方根偏差，RMSD为1.1 ?），组蛋白二聚体之间存在广泛的堆叠相互作用；而开放构象则前所未见，其螺距（约63.0 ?）几乎是闭合构象（约29.5 ?）的两倍，且二聚体间缺乏堆叠作用。

开放和闭合HHoB核小体在多种Mg²⁺条件下共存并形成超核小体

鉴于Mg²⁺在细胞内的关键作用及其对染色质结构的已知影响，团队系统研究了Mg²⁺浓度（0-100 mM）对HHoB核小体结构的影响。冷冻电镜二维分类分析表明，在1-60 mM Mg²⁺范围内，开放和闭合构象的核小体共存。当Mg²⁺浓度升至80-100 mM时，仅观察到闭合构象；而在完全无Mg²⁺的条件下，则只存在开放构象。更为重要的是，即使在较低Mg²⁺浓度下，单个核小体也能通过末端DNA的相互作用，“首尾相连”地组装成延展的超核小体纤维。随着Mg²⁺浓度增加，超核小体的长度和有序度显著增加。电泳迁移率变动分析也证实，高Mg²⁺条件下HHoB与DNA的结合协同性增强，表现为单一的迁移条带，类似于HMfB的行为。这种由Mg²⁺介导的超核小体形成并非序列特异性，因为使用源自LC3基因组的天然DNA序列也能观察到类似现象。

冷冻电镜解析闭合和开放HHoB超核小体结构

为了获得高分辨率结构，团队分别解析了在100 mM Mg²⁺条件下（100%闭合态）的闭合超核小体和在20 mM Mg²⁺条件下富集的开放超核小体结构。闭合超核小体结构以2.6 ?的高分辨率被解析，清晰地展示了组蛋白二聚体连续包裹DNA形成紧密左手超螺旋的细节，其结构与HMfB超核小体高度相似。相比之下，开放超核小体由于柔性较大，分辨率较低（~10 ?），但其基本构象与单个开放核小体一致。在两种超核小体中，DNA末端相互作用形成连续的超级螺旋，组蛋白二聚体则沿其全长进行包裹。开放超核小体的稳定主要依赖于组蛋白-DNA界面以及最小化的二聚体-二聚体界面，而无需组蛋白堆叠作用的参与。

开放与闭合核小体的关键界面分析

通过精细的结构比较，研究人员揭示了三种关键界面在决定核小体构象中的作用：

1. 1.
   组蛋白二聚体-DNA界面：该界面在开放和闭合状态下高度保守，主要由Arg9、Arg15、Arg21、Lys55和Lys58等残基参与。
2. 2.
   组蛋白二聚体-二聚体界面：这是构象差异的核心。当对齐相邻的二聚体时，开放态中二聚体N与N+1之间的夹角比闭合态陡峭约21°，导致了超螺旋的大幅伸展。参与该界面的残基（如Tyr44, Glu47, His51等）在两种状态下采取了不同的取向和相互作用网络，使得开放态的界面面积（~558 ?2）远小于闭合态（~727 ?2）。
3. 3.
   堆叠界面（仅存在于闭合态）：该界面主要由带相反电荷的残基（如Gln16, Lys29, Glu32, Arg50, Lys63等）之间的静电相互作用介导，像“魔术贴”一样将不同层的组蛋白二聚体紧密连接，极大地增加了闭合超核小体的整体稳定性（每个二聚体总界面面积是开放态的2.2倍）。

为了验证结构观察，团队设计了关键突变体。将开放态的关键残基Tyr44突变为Ala，并在48位引入Tyr以模拟真核H3-H4八聚体（octasome）中Tyr的位置（突变体mut1: Y44A-I48Y）。电镜分析显示，该突变体虽然仍能形成开放和闭合态，但开放程度减小，更接近H3-H4八聚体的开放程度，支持了Tyr44在稳定开放态中的作用。另一方面，破坏闭合态堆叠界面的三重突变体（mut2: K29A E32A D36A）在高Mg²⁺条件下形成的超核小体变得无序和“摇晃”，证明了堆叠界面对于闭合超核小体刚性结构的重要性。

生物物理学实验显示HHoB核小体行为依赖于Mg²⁺浓度

单分子力谱和系留粒子运动实验为Mg²⁺的调控作用提供了力学证据。力谱测量表明，在0 mM Mg²⁺条件下，拉伸HHoB-DNA复合物所需的力显著低于1 mM和50 mM Mg²⁺条件，尤其是在高拉伸程度下，力差可达约7 pN，说明Mg²⁺存在时染色质纤维更为紧凑、稳定。系留粒子运动实验进一步定量显示，在HHoB滴定过程中，加入1 mM Mg²⁺会使DNA压缩的 midpoint concentration 左移，且饱和状态下的复合物更加紧凑，直接证实了Mg²⁺促进超核小体形成和压缩的作用。

结论与意义

本研究首次揭示了阿斯加德古菌染色质存在开放和闭合两种截然不同的超核小体组装状态。闭合状态与之前在广古菌中观察到的结构高度保守，表明这种紧密包装的染色质形式是古菌界的共同特征。而开放状态则代表了古菌染色质结构的新范式，其伸展的构象与真核生物的H3-H4八聚体有相似之处，提示它可能是通向真核核小体进化过程中的一个关键“中间态”或阿斯加德古菌的特有创新。序列分析发现，稳定开放态的关键残基Tyr44在阿斯加德古菌（尤其是霍德古菌）组蛋白中显著富集，而在广古菌中极为罕见，这从进化角度支持了开放态是阿斯加德古菌潜在的重要特征。

研究的另一重要发现是Mg²⁺离子作为染色质状态的动态调节器。Mg²⁺通过屏蔽DNA磷酸骨架的负电荷，促进组蛋白与DNA结合的协同性，并稳定闭合态的堆叠界面，从而驱动染色质从开放、动态的状态向闭合、紧凑的超核小体纤维转变。这种由环境因子（如离子浓度）调控染色质构象的机制，可能为古菌在多变环境中灵活调整基因组可及性和稳定性提供了策略。

综上所述，这项研究不仅提供了阿斯加德古菌染色质的首个高分辨率结构模型，极大地拓展了我们对染色质结构多样性的认识，更重要的是，它将阿斯加德古菌的染色质结构与真核生物染色质的潜在起源联系起来。开放态的存在为理解组蛋白变体交换、DNA复制和转录过程中染色质动态调节的早期进化提供了新的视角。该研究描绘的“可变珠子串”模型，即由不同组蛋白变体形成长度和构象各异的超核小体，并由Mg²⁺等因子调控其动态平衡，为未来探索更复杂的阿斯加德染色质调控机制奠定了坚实的基础。