PARP15通过ART结构域二聚化调控ADP-核糖基转移酶活性的机制研究

《Nature Communications》：Regulation of ADP-ribosyltransferase activity by ART domain dimerization in PARP15

本研究揭示了PARP15通过其ART结构域形成同源二聚体来激活单ADP-核糖基化（MARylation）活性的新机制。研究人员通过X射线晶体学、氢氘交换质谱（HDX-MS）等技术发现，二聚化界面关键残基R576和D665形成的盐桥网络对催化活性至关重要，二聚体构象使受体位点更利于靶标结合。该发现为PARP家族酶活性调控提供了新视角，对病毒防御和癌症治疗研究具有重要意义。

　　

在细胞应对压力的复杂调控网络中，ADP-核糖基化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰，参与DNA损伤修复、转录调控和抗病毒防御等多个关键生物学过程。多聚(ADP-核糖)聚合酶（PARP）家族是这一过程的主要执行者，其中PARP15作为含有宏结构域的PARP亚家族成员，因其在应激颗粒中的定位和潜在的抗病毒功能而备受关注。然而，尽管科学家们对PARP15的结构和功能有了一定了解，但其酶活性调控的具体分子机制仍不清楚，这限制了我们对该蛋白在生理和病理条件下功能的深入理解。

发表在《Nature Communications》的这项研究首次揭示PARP15通过其ADP-核糖基转移酶（ART）结构域的二聚化来激活催化活性的精细调控机制。研究人员发现，与同家族蛋白PARP14和PARP10的ART结构域不同，PARP15的ART结构域在溶液中能形成高亲和力的同源二聚体，且这种二聚化是其催化活性的必要条件。

为系统阐明这一调控机制，研究团队综合运用了多种生物物理和结构生物学技术。通过尺寸排阻色谱-多角度光散射联用（SEC-RALS/LALS）技术，研究人员首先确认PARP15 ART结构域在溶液中的二聚体状态，而PARP14和PARP10的对应结构域则呈现单体形式。化学交联实验和质谱分析进一步验证了二聚界面的存在，氢氘交换质谱（HDX-MS）则揭示了二聚界面区域在氘代实验中受到保护，表明该区域在二聚体形成过程中参与紧密的相互作用。

尤为关键的是，X射线晶体学分析显示，PARP15 ART结构域在所有已知晶体结构中均以二聚体形式存在，二聚界面由每个原体中的α2螺旋以及R576和D665残基间形成的盐桥网络构成。AlphaFold3结构预测也以高置信度支持这一二聚界面模式。

研究人员通过点突变实验证实了二聚化对催化活性的必要性。将界面关键残基R576和D665突变为丙氨酸或带相反电荷的氨基酸（如R576E、D665R）后，突变体主要以单体形式存在，且其自MAR化和转MAR化活性显著降低甚至完全丧失。浓度梯度实验显示，野生型PARP15的酶活性在蛋白浓度超过200nM时急剧增加，这与通过分析超速离心（AUC）测得的二聚解离常数（K_d=313nM）相吻合，而单体突变体在整个浓度范围内均无活性。

有趣的是，研究发现二聚体中的两个原体催化活性相互独立。将催化失活突变体（H559Y）与野生型PARP15混合，在总浓度超过二聚解离常数时，可观察到MAR化活性恢复，表明一个原体的催化活性不依赖于另一个原体的功能完整性。

为阐明二聚化激活催化的结构基础，研究人员解析了单体突变体R576E与烟酰胺类似物3-氨基苯甲酰胺（3AB）的复合物晶体结构。虽然该突变体在晶体中也形成二聚体，但界面相互作用明显减弱，特别是D-loop基部发生构象变化，导致其无法在生理浓度下形成稳定二聚体。等温滴定量热法（ITC）分析表明，单体突变体与NAD+类似物EB-47的结合亲和力虽略有下降，但仍能结合配体，说明二聚化激活机制主要不是通过影响NAD+结合实现的。

HDX-MS分析提供了更深层次的机制见解：与野生型相比，R576E突变体中β6-β7和β7-β8环区域表现出更高的柔性，且对EB-47结合不响应。这些区域包含参与二聚界面的残基和催化关键残基L659（对应于PARP1中的催化谷氨酸），表明二聚化通过稳定这些环的构象，使受体位点处于适于催化的状态。

PARP15二聚化通过其ART结构域

研究发现PARP15 ART结构域在溶液中形成二聚体，解离常数为313nM。与此相反，同源蛋白PARP14和PARP10的ART结构域则呈现单体状态。多种生物物理方法均证实了PARP15二聚体的存在及其界面特征。

催化活性需要二聚体形成

二聚界面关键残基（R576和D665）的突变体均丧失二聚化能力，并导致酶活性急剧下降。浓度依赖性实验表明，酶活性在蛋白浓度超过二聚解离常数时显著增强，进一步证实二聚化是催化活性的前提。

全长PARP15在细胞内具有二聚化依赖性活性

在HEK293T细胞中表达二聚界面突变体，发现其MAR化水平显著降低，且蛋白的亚细胞定位发生改变，表明二聚化不仅调控PARP15的催化活性，也影响其细胞内分布。

PARP15二聚化的潜在激活机制

结构分析和HDX-MS表明，二聚化通过稳定D-loop和β6-β8区域，使受体位点处于适于靶标结合和催化的构象。二聚体中的两个原体独立行使功能，且未发现NAD+结合协同性。

本研究揭示了PARP家族酶活性调控的一种新机制——催化结构域同源二聚化。与需要DNA结合或聚合才能激活的PARP1和tankyrase不同，PARP15的激活仅依赖于其ART结构域的二聚化，代表了一种更为直接的调控策略。这一发现不仅深化了对PARP家族功能调控的理解，也为针对PARP15相关疾病（如病毒感染和癌症）的治疗策略开发提供了新思路。特别值得注意的是，二聚化可能通过调节PARP15在应激颗粒中的富集程度来影响其功能，这为理解生物分子凝聚物中的酶活性调控提供了新视角。鉴于AlphaFold3预测其他PARP家族成员（如PARP7、-11和-12）也可能通过类似界面形成二聚体，该研究可能揭示了一种在PARP家族中更为普遍的调控机制。