果蝇长期记忆转录轨迹的时间进程分析揭示Hr38和sr在记忆巩固中的关键作用

《Nature Communications》：A memory transcriptome time course reveals essential long-term memory transcription factors

本研究针对长期记忆(LTM)形成的转录调控机制不明确的问题，通过果蝇求偶条件化模型，采用转录组时间进程分析、单细胞RNA测序和功能筛选等技术，发现蘑菇体特异性转录记忆轨迹，并鉴定出16个LTM必需基因，其中转录因子Hr38和sr可能通过调控记忆相关基因表达来塑造LTM转录程序，为理解记忆形成的分子基础提供了新见解。

　　

记忆是如何形成的？这一直是神经科学领域的核心问题。我们知道，短期记忆转化为长期记忆需要新蛋白质的合成，这意味着基因转录的激活是关键环节。然而，记忆形成过程中具体的转录调控机制仍然是个黑箱。特别是在果蝇这样的模式生物中，尽管其记忆中心蘑菇体(Mushroom Body, MB)的作用已被广泛认可，但记忆诱导的转录组变化仍知之甚少。

与哺乳动物系统中Arc、cFos等记忆即早基因(Immediate-Early Genes, IEGs)已被充分表征不同，果蝇中尚未发现参与记忆形成的IEGs。先前的研究虽然通过全头或MB神经元的转录组分析鉴定出一些记忆诱导基因，但不同数据集之间重叠很少，且缺乏对经验诱导细胞的详细转录分析。显然，我们需要对记忆转录组进行更全面的分析。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，Spencer G. Jones、Beatriz Gil-Marti等研究人员通过多组学方法，揭示了果蝇长期记忆形成过程中蘑菇体特异的转录轨迹，并鉴定出两个关键的转录因子Hr38和sr，它们可能帮助塑造长期记忆的转录反应。

为了开展这项研究，研究人员主要应用了几个关键技术：首先，利用细胞核特异性分离技术(INTACT)从果蝇蘑菇体中分离细胞核进行RNA测序，建立了求偶长期记忆形成的转录组时间进程；其次，采用CREB活性报告系统(CAMEL)结合荧光激活细胞分选(FACS)和单细胞RNA测序(scRNA-seq)，在单细胞水平上识别并分析了记忆印迹细胞；此外，还通过染色质可及性测定(ATAC-seq)分析了记忆形成中的染色质结构变化；最后，利用RNA干扰技术进行了大规模功能筛选，验证了候选基因在长期记忆形成中的必要性。

一个MB特异性的求偶长期记忆转录轨迹

研究人员在果蝇暴露于求偶条件化训练的不同时间点，对MB和全头(Whole Head, WH)核进行RNA测序，建立了转录组时间进程。通过比较训练果蝇和时间匹配的幼稚果蝇，他们发现MB中存在一个特异的转录记忆轨迹，在训练后期和训练后早期记忆巩固阶段被激活。

具体而言，MB特异性训练诱导基因(Training-Induced Genes, TIGs)在训练开始时(1小时)被强烈诱导，训练中期表达降低，而在训练结束时(7小时)和训练后1小时重新被诱导。这些基因富含与长期记忆细胞相关性相关的功能，包括肌动蛋白细胞骨架组织、有氧呼吸等过程。值得注意的是，与能量代谢相关的基因在MB中显示持续诱导，这与MB在记忆巩固期间经历高代谢需求的观点一致。

训练后翻译对求偶长期记忆的需求

研究发现在幼稚MB中，翻译相关基因的表达随昼夜节律活动波动，而在训练果蝇中，这种模式被完全破坏。翻译基因在训练期间和训练后的巩固期间维持更一致的表达水平。通过环己酰亚胺(Cycloheximide, CXM)喂养实验，研究人员证实翻译确实为求偶长期记忆所必需，且训练后时期的翻译对正常长期记忆形成最为关键。

长期记忆形成过程中记忆信号基因的表达改变

研究人员发现，与记忆信号相关的基因，如G蛋白偶联受体信号和cAMP介导的信号通路基因，在训练期间维持其表达，持久高于幼稚水平，直到训练结束或训练后1小时。这与幼稚MB中这些基因随日常活动节律波动的模式形成鲜明对比，表明求偶长期记忆训练导致记忆信号基因表达的时间维持。

持久记忆印迹细胞的分离

为了识别可能代表求偶记忆印迹的CREB激活神经元，研究人员使用了CAMEL工具，这是一个MB特异的转基因构建体，能响应激活的CREB产生GFP。他们发现训练果蝇在训练24小时后，CAMEL阳性MB神经元的数量显著增加，而在记忆缺陷型Adcy1突变体中未观察到这种变化。通过在CAMEL阳性神经元中表达神经沉默工具TNT^G，特异性阻断CREB诱导的MB神经元的神经输出，研究人员证实这些神经元对求偶长期记忆是必需的。

潜在记忆印迹细胞的识别

对CREB激活的MB神经元进行单细胞RNA测序分析，揭示了五个不同的神经元群体。其中，簇4和簇5主要包含来自训练动物的MB细胞，并富含与记忆形成相关的过程，如"学习和记忆"、"突触传递"、"G蛋白偶联受体信号"等。这些簇中记忆诱导基因的表达表明，记忆印迹细胞在转录上富含典型的长期记忆形成过程。

细胞类型非依赖性记忆基因的识别

为了识别独立于MB身份的候选记忆基因，研究人员去除了在MB中显示富集表达的基因，重新进行主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)，确定了三个簇。簇C主要包含来自训练动物的MB神经元，并显示记忆巩固核心TIGs的表达，揭示了可能参与记忆过程的候选基因，这些基因独立于MB细胞身份。

候选基因的功能缺失筛选

作为因果性证明，研究人员对48个候选基因进行了功能筛选，发现16个基因的破坏会损害长期记忆。这些阳性命中包括信号传导(MAPK-CG7378、WNT-pan)、转录(Hr38、sr、cpo、fs(1)h)、泛素化(CG2915、CG17691、CG11700)和突触(svr和coracle)相关基因。特别值得注意的是，从簇C和INTACT RNAseq核心TIGs中测试的基因有较高比例被确认为记忆调节因子，支持了转录组分析揭示新的记忆基因的观点。

果蝇记忆活性调节基因的识别

在功能筛选的阳性命中中，两个转录因子Hr38和stripe(sr)此前被鉴定为神经元活性诱导基因，因此代表了可能调控求偶长期记忆转录反应的候选活性调节基因(Activity-Regulated Genes, ARGs)。当在训练前1天在MB中诱导Hr38和sr RNAi时，仅在长期记忆中观察到缺陷，而在短期记忆中无缺陷。这表明在成年MB中，sr可能对长期记忆有非常特异的作用，而Hr38似乎有更广泛的作用。

Hr38和Sr与TIGs和印迹基因的结合

为了探索求偶长期记忆训练诱导基因表达的潜在机制，研究人员分析了MB核的染色质结构。有趣的是，Hr38和sr在其转录起始位点附近显示高度可及的染色质景观。此外，CrebB结合位点与MB特异的ATAC-seq峰在Hr38和sr的转录起始位点直接重叠，表明Hr38和sr可能是CrebB的直接靶标。

在构成MB特异性求偶长期记忆轨迹的756个MB TIGs中，306个被CrebB、Hr38和/或sr结合，其中超过一半被两个或多个这些转录因子结合。这些转录因子结合的TIGs在MB中显示训练后期和训练后的激活显著大于全头，表明CrebB、Hr38和Sr可能协同激活MB特异的求偶长期记忆训练转录轨迹的表达，这种轨迹从训练早期持续到记忆回忆。

这项研究通过转录组时间进程分析揭示了果蝇蘑菇体中长期记忆巩固的特异转录轨迹，并利用单细胞RNA测序识别出显示持久转录特征的CREB激活MB细胞群体。功能筛选鉴定出16个长期记忆必需基因，其中Hr38和sr作为候选记忆活性调节基因，可能通过调控记忆相关基因表达来塑造长期记忆转录程序。这些发现显著推进了我们对促进长期记忆的转录程序的理解，并确定了可能控制这些程序的关键转录因子。

该研究的创新之处在于首次在果蝇中系统揭示了长期记忆形成的动态转录调控网络，并鉴定出Hr38和sr作为重要的记忆调节转录因子。这些发现不仅对理解记忆形成的分子机制有重要理论意义，也为研究其他物种中的记忆机制提供了重要参考。值得注意的是，Hr38和sr分别是哺乳类中NR4A2和EGR1的直系同源物，后者已被描述对学习和记忆很重要，这提示记忆的转录调控机制可能在进化上具有一定保守性。

总体而言，这项研究为理解记忆形成的转录调控机制提供了重要见解，揭示了蘑菇体特异性转录轨迹在长期记忆形成中的关键作用，并确定了Hr38和sr等转录因子作为记忆调控的新玩家，为后续研究记忆障碍性疾病提供了新的分子靶点和思路。