BRCA2缺陷通过APOBEC3B介导的尿嘧啶积累与自我放大循环驱动基因组不稳定性

《Nature Communications》：BRCA2 deficiency and replication stress drive APOBEC3-Mediated genomic instability

本研究针对BRCA2缺陷如何引发复制叉崩溃及基因组不稳定性这一关键问题，揭示了APOBEC3B(A3B)通过尿嘧啶积累、UNG2/APE1加工及NF-κB信号激活形成的自我放大循环新机制。研究人员发现BRCA2缺失导致停滞复制叉处单链DNA(ssDNA)积累，A3B催化胞嘧啶脱氨形成尿嘧啶，经UNG2和APE1加工后引发复制叉崩溃，产生的胞质ssDNA片段激活NF-κB信号进而上调A3B表达。该研究不仅阐明了BRCA2缺陷特异性易受APOBEC3B介导突变影响的分子基础，还为BRCA2突变肿瘤的治疗策略提供了新靶点。

　　

在肿瘤生物学领域，BRCA2基因的突变与乳腺癌、卵巢癌等多种癌症的发生密切相关。尽管已知BRCA2在DNA损伤修复和复制叉稳定中发挥关键作用，但BRCA2缺陷如何具体导致复制叉崩溃并驱动基因组不稳定性，仍存在重要知识空白。尤其令人困惑的是，为什么BRCA2缺陷细胞会对某些治疗策略产生耐药性，以及其基因组不稳定的具体分子机制是什么。这些问题的解答对于改善BRCA2突变携带者的治疗结果至关重要。

本研究发表在《自然通讯》杂志上，旨在揭示BRCA2缺陷细胞中基因组不稳定的新机制。研究人员发现，复制应激触发的APOBEC3B活性在BRCA2缺陷细胞中形成了一个自我放大的突变循环，这一发现为理解BRCA2相关肿瘤的进化提供了新视角。

研究人员运用了多种关键技术方法，包括：使用催化失活的UNG2探针(3XFLAG-ΔUNG)检测单链DNA中的尿嘧啶积累；通过碱性位点检测(ARP assay)评估AP位点形成；采用DNA纤维分析技术研究复制叉降解；利用中和彗星实验检测DNA双链断裂；通过免疫荧光和邻近连接技术(PLA)分析蛋白质定位和胞质ssDNA积累；结合细胞活力测定评估药物敏感性；并对TCGA卵巢癌数据集进行临床相关性分析。

BRCA2缺陷促进复制应激诱导的尿嘧啶积累

研究人员开发了一种特异性检测单链DNA中尿嘧啶(U-ssDNA)的方法，发现BRCA2缺陷细胞在顺铂或羟基脲处理后显著积累U-ssDNA。这一现象在BRCA2突变肿瘤细胞系(PEO1和CAPAN1)中也被证实，而其BRCA2恢复的同基因对照细胞则显示U-ssDNA积累减少。重要的是，BRCA1缺陷细胞并未表现出类似的U-ssDNA积累，表明这是BRCA2缺陷的特有表型。

复制应激诱导的S期单链DNA是BRCA2缺陷细胞尿嘧啶积累的底物

通过PCNA和pRPA32共染色实验，研究人员证实U-ssDNA主要积累在S期细胞的停滞复制叉处。S1核酸酶处理能显著降低U-ssDNA信号，而RNaseA处理无影响，确认了尿嘧啶积累的特异性。这些结果表明，复制应激诱导的单链DNA是APOBEC3B催化尿嘧啶积累的主要底物。

BRCA1缺陷不会诱导复制应激下的U-ssDNA积累

与BRCA2缺陷形成鲜明对比的是，BRCA1缺陷细胞在复制应激下既不积累U-ssDNA，也不显示AP位点增加。这种差异可能与BRCA1和BRCA2缺陷细胞中单链DNA产生和解决的机制不同有关，突显了这两种相关但功能不同的肿瘤抑制因子在复制叉处理中的独特作用。

复制应激下BRCA2缺陷细胞中UNG2依赖的脱嘌呤/脱嘧啶位点积累

由于尿嘧啶从DNA中移除会生成AP位点，研究人员检测了BRCA2缺陷细胞中AP位点的积累。结果显示，BRCA2缺陷细胞在复制应激下AP位点显著增加，而UNG2的共缺失或敲除能抑制这一现象。SMUG1缺失则不影响AP位点积累，表明UNG2是BRCA2缺陷细胞中处理U-ssDNA的主要糖苷酶。

UNG2和APE1驱动BRCA2缺陷细胞在复制应激下的停滞叉降解和基因组不稳定性

通过DNA纤维分析、53BP1焦点形成和微核形成实验，研究人员证实UNG2和APE1是BRCA2缺陷细胞中复制叉降解和基因组不稳定的关键介质。UNG2或APE1的缺失能挽救复制叉降解，减少DNA损伤和微核形成。临床数据分析显示，APE1低表达与BRCA2突变卵巢癌患者的不良预后相关。

APOBEC3B驱动BRCA2缺陷细胞的尿嘧啶积累和基因组不稳定性

A3B的缺失几乎完全抑制了BRCA2缺陷细胞在复制应激下的U-ssDNA积累。重要的是，重新表达野生型A3B能恢复微核形成，而催化失活突变体(A3B-E255Q)则不能。A3B缺失还能挽救BRCA2缺陷细胞对羟基脲和顺铂的敏感性，证实了A3B在驱动基因组不稳定性和治疗反应中的关键作用。

BRCA2缺陷诱导复制应激下的APOBEC3B过表达和单链DNA积累

有趣的是，BRCA2缺陷细胞在复制应激下显示A3B在mRNA和蛋白水平上的显著上调。这种上调是BRCA2特异性的，因为BRCA1缺陷细胞无此现象。研究人员通过转染外源性单链DNA模拟复制叉崩溃后的情况，发现单链DNA而非双链DNA能诱导A3B表达，表明胞质单链DNA片段可能作为A3B上调的触发信号。

BRCA2缺陷诱导APOBEC3B、UNG2和APE1依赖的胞质单链DNA积累

通过邻近连接实验(PLA)，研究人员证实BRCA2缺陷细胞在复制应激后积累胞质单链DNA片段。A3B、UNG2或APE1的缺失能抑制这种积累，支持了APOBEC3B介导的胞嘧啶脱氨和后续加工导致复制叉崩溃并产生胞质DNA片段的模型。

UNG2和APE1活性驱动BRCA2缺陷细胞在复制应激下的APOBEC3B上调

UNG2或APE1的缺失不仅减少胞质单链DNA积累，还抑制A3B的上调。这表明UNG2和APE1不仅参与复制叉崩溃，还通过调节A3B表达维持突变循环。在UNG2敲除细胞中，A3B上调和U-ssDNA积累均显著减少，证实了UNG2在这一自我放大循环中的核心作用。

NF-κB激活驱动BRCA2缺陷细胞在复制应激下的APOBEC3B上调

机制上，研究人员发现复制应激诱导RELB核转位，表明非经典NF-κB通路激活。NF-κB抑制剂处理能抑制A3B表达和U-ssDNA积累，证实了NF-κB信号在介导A3B上调中的重要性。临床数据分析进一步显示，高APOBEC3水平和低APE1表达的BRCA2突变肿瘤患者预后最差。

APOBEC3B表达影响BRCA2突变卵巢癌患者的生存

临床数据分析揭示，APOBEC3水平与BRCA2突变卵巢癌患者的生存结果相关。高APOBEC3和低APE1表达的肿瘤患者预后最差，表明APOBEC驱动的突变在低APE1背景下可能使肿瘤更有效地进化并获得治疗耐药性。

本研究揭示了一个以前未被认识的BRCA2缺陷细胞突变级联反应，由复制应激触发并由APOBEC3B、UNG2和APE1驱动。这一级联不仅加剧复制叉降解，还促进A3B进一步上调，形成一个自我放大的反馈循环，加剧BRCA2缺陷细胞的基因组不稳定性。

研究结果表明，BRCA2缺陷细胞中复制应激导致停滞复制叉处单链DNA过度积累，这为A3B驱动的胞嘧啶脱氨提供了理想底物。产生的尿嘧啶被UNG2和APE1加工，导致DNA切割和复制叉崩溃。重要的是，APE1介导的加工产生的单链DNA片段进入胞质后激活NF-κB信号，导致A3B上调。因此，A3B不仅启动复制叉崩溃，还通过胞质DNA-NF-κB轴促进自身表达，放大复制相关的基因组损伤。

这一发现对BRCA2突变癌症的治疗具有重要意义。目前BRCA2突变癌症常用铂类和PARP抑制剂治疗，虽然初期有效，但耐药性不可避免。本研究提出UNG2和APE1作为BRCA2缺陷细胞药物敏感性的调节因子，为针对这一突变反馈环的治疗策略提供了新靶点。临床数据进一步支持了这一通路的重要性，表明APOBEC3B高表达和APE1低表达的患者可能代表高风险亚组，可能受益于针对这一突变反馈环的靶向治疗策略。

总之，这些发现揭示了BRCA2缺陷细胞的一个独特且临床相关的脆弱性——一个涉及APOBEC3B、UNG2、APE1和胞质单链DNA片段的自我放大突变反馈循环。这一循环将复制应激与胞嘧啶脱氨、停滞复制叉崩溃、A3B上调和UNG2/APE1驱动的基因组不稳定性联系起来，深化了我们对BRCA2缺陷肿瘤如何进化的理解，并为改善BRCA2突变癌症的预后提供了新的治疗机会。