SND3作为膜插入酶在独特的SEC61转位子复合物中的作用机制

《Nature Communications》：SND3 is the membrane insertase within a distinct SEC61 translocon complex

本研究针对真核生物整合膜蛋白生物发生中SND途径机制不清的问题，通过冷冻电镜技术解析了嗜热毛壳菌核糖体结合的SND3转位子复合物结构，发现SND3是一种具有非典型折叠的膜插入酶，与SEC61转位子、CCDC47和TRAPα形成独特的多重跨膜转位子，为理解真菌等多重跨膜蛋白的共翻译插入机制提供了重要见解。

　　

在真核细胞中，整合膜蛋白占全部蛋白质组的20-30%，承担着膜运输、细胞信号传导和生物合成等关键生物学功能。这些蛋白质的生物发生始于它们在内质网膜的插入过程，其中跨膜结构域的精准整合是功能实现的基础。尽管科学家已经发现了多条膜蛋白插入途径，如信号识别颗粒依赖的SEC61途径和尾锚定蛋白的GET途径等，但SRP非依赖的SND途径始终是其中最不为人知的一条通路。

SND途径最初在酿酒酵母和人类细胞中被发现，被认为能够介导多种类型整合膜蛋白的膜插入，包括第一个跨膜结构域位于蛋白质序列中间的膜蛋白、糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白和短分泌蛋白等。然而，由于缺乏对SND途径关键组分的结构信息，科学家对其具体作用机制一直知之甚少。特别是SND3作为SND途径的核心组分，在酵母中的缺失会导致更严重的生长缺陷和底物错误定位，暗示其在真菌膜蛋白生物发生中可能发挥着比目前认知更为关键的作用。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，研究人员通过综合运用结构生物学、生物化学和计算生物学方法，揭示了嗜热毛壳菌SND3的结构特征及其在膜蛋白插入中的分子机制。研究不仅首次解析了核糖体结合的SND3转位子复合物的高分辨率结构，还通过分子动力学模拟揭示了SND3作为膜插入酶的作用机制。

研究人员主要采用了冷冻电镜单颗粒分析技术解析复合物结构，利用分子动力学模拟研究膜相互作用，通过亲和纯化与质谱分析鉴定复合物组分，并采用基因组编辑技术构建工程菌株。从嗜热毛壳菌中制备的膜样本为研究提供了天然状态下的蛋白质复合物。

SND3与PAT复合物和核糖体的共纯化

为了分离天然的SND3相关复合物，研究人员在嗜热毛壳菌中构建了C端带有TwinStrep标签的SND3工程菌株。通过亲和纯化和尺寸排阻色谱，他们发现PAT复合物与去垢剂溶解的SND3共同洗脱。进一步实验证实，一部分SND3与核糖体共同沉淀，负染电镜初步显示核糖体隧道出口处存在额外密度。通过优化纯化策略，研究人员成功获得了包含SND3、CCDC47、SEC61转位子和TRAPα的完整复合物。

嗜热毛壳菌核糖体结合SND3转位子的结构特征

冷冻电镜分析最终以2.2埃的整体分辨率解析了核糖体结合的SND3转位子复合物结构。该结构显示，在核糖体隧道出口处的去垢剂胶束中，存在着清晰的CCDC47、SEC61转位子三个亚基、SND3和TRAPα的密度特征。SEC61转位子以典型位置直接位于核糖体隧道出口下方，与核糖体亚基uL23、eL19和26S rRNA保持保守相互作用。

CCDC47和SEC61β阻止新生链进入SEC61通道

结构分析揭示，CCDC47的C端闩锁螺旋被夹在核糖体隧道出口和SEC61α通道入口之间，有效阻碍了新生链进入SEC61α的胞质腔。同时，研究人员首次解析了SEC61β胞质N端区域的结构，发现其包含一个核糖体结合域和一个腔结合域。SEC61β的腔结合域在SEC61α胞质腔内形成U形转折，与CCDC47协同作用，进一步加强了对SEC61通道的封闭。

真菌TRAPα的结构见解

研究证实真菌TRAPα以单一亚基形式与SEC61转位子结合，其跨膜结构域与SEC61α腔面铰链域相互作用。与后生动物TRAPα相比，真菌TRAPα的腔面结构域向SND3方向偏移约10埃，这种构象变化可能与其功能适应性相关。

SND3具有膜插入酶的特征

SND3拥有四个跨膜结构域，其中TMD1和TMD4较短且不完全跨越膜双层。其胞质环形成爪状结构，在膜平面附近形成亲水性拱门。更重要的是，SND3的TMD2、TMD3和TMD4在膜胞质叶内形成了一个膜嵌入的亲水凹槽，这一特征与Oxa1超家族膜插入酶相似，但SND3的折叠方式和拓扑结构与该超家族成员存在显著差异。

SND3破坏脂双层并介导脂质 scrambling

分子动力学模拟显示，SND3的短跨膜结构域附近出现明显的膜变薄现象，磷脂头基被吸引至SND3的亲水凹槽内。水分子能够与SND3亲水凹槽的极性残基相互作用，形成从胞质到膜核心的亲水路径。粗粒度模拟进一步发现，磷脂分子能够沿着这一亲水路径在膜双层间发生翻转，表明SND3具有脂质 scrambling活性。

SND3转位子类似于多重跨膜转位子

结构比较表明，SND3转位子与后生动物多重跨膜转位子具有相似的组织方式。CCDC47和SEC61转位子的相互作用在两者间保守，但SND3转位子中CCDC47的N端结构域发生重排，使得SND3占据了后生动物多重跨膜转位子中TMCO1插入酶的位置。这种结构适应性使得真菌能够以更简化的复合物实现类似的功能。

研究结论表明，SND3转位子代表了一种在真菌、眼虫寄生虫等真核生物中存在的简化版多重跨膜转位子，通过SND3的膜插入酶活性介导多重跨膜蛋白的共翻译插入。这一发现不仅阐明了SND途径在膜蛋白生物发生中的核心作用，还为理解不同真核生物中膜蛋白插入机制的进化提供了重要视角。

该研究的讨论部分强调，SND3转位子的发现为理解真核生物膜蛋白生物发生的进化提供了关键连接点。SND3与TMCO1在不同真核生物类群中的互斥分布暗示了多重跨膜转位子可能通过不同进化路径独立出现。同时，SEC61β在阻断SEC61通道中的新发现重新定义了其在蛋白质转运中的功能，为理解转位子功能的精细调控提供了新思路。