SETD2通过SPT6介导的转录偶联H3K36me3沉积分子机制解析

《Nature Communications》：Molecular mechanism of co-transcriptional H3K36 methylation by SETD2

本研究针对转录过程中组蛋白修饰H3K36me3如何精确沉积这一关键科学问题，通过冷冻电镜结构解析与功能验证，首次揭示了SETD2与RNA聚合酶II延伸复合物结合的三步工作机制。研究发现SPT6-SETD2相互作用对H3K36me3沉积至关重要，并鉴定了一个后生动物特有的SETD2自抑制域酸性插入调控元件，为理解转录偶联表观遗传记忆提供了分子基础。

　　

在真核细胞中，遗传信息存储在染色质中，而染色质的基本单位是核小体。当基因需要被转录时，RNA聚合酶II(Pol II)必须在核小体阵列中穿行，这个过程需要克服巨大的空间位阻。尽管Pol II在核小体中穿行会引发大规模的染色质结构变化，但通常涉及核小体从Pol II前方的下游DNA转移到Pol II后方的上游DNA。这种核小体转移机制有助于保留组蛋白上携带的共价修饰信息，这些修饰构成了细胞的"表观遗传记忆"。

在所有这些修饰中，组蛋白H3第36位赖氨酸的三甲基化(H3K36me3)尤为引人注目。作为活跃转录和近期转录基因的标志，H3K36me3在细胞记忆和身份维持中发挥关键作用。这种修饰由甲基转移酶SETD2催化完成，该酶与转录中的Pol II结合，在转录过程中沉积H3K36me3。然而，二十多年来，科学家们一直不清楚Pol II核小体穿行如何与转录偶联的组蛋白修饰相协调。

发表在《Nature Communications》上的这项研究通过整合结构生物学和生物化学方法，揭示了SETD2在转录过程中沉积H3K36me3的精确分子机制。研究人员发现H3K36me3沉积发生在Pol II穿行核小体之后的上游核小体上，并首次解析了SETD2与Pol II延伸复合物结合的三个关键状态的冷冻电镜结构。

研究团队主要运用了单颗粒冷冻电镜技术解析复合物结构，通过体外重建转录系统进行功能验证，采用化学交联质谱分析蛋白质相互作用，并利用凝胶迁移实验和凝胶过滤分析研究蛋白质-核酸相互作用。此外，还通过RNA延伸实验和同位素标记的甲基化分析评估酶活性。

H3K36me3沉积需要Pol II核小体穿行

为了研究共转录H3K36me3沉积的机制，研究人员首先确定了SETD2是甲基化转录Pol II下游还是上游的核小体。通过RNA延伸实验和Western blot分析，他们发现只有在转录进行到模板末端时才能检测到H3K36me3信号，而当Pol II停滞在核小体内部时则没有甲基化发生。这表明共转录H3K36me3沉积发生在Pol II穿行后的上游核小体上。

准备就绪的甲基化复合物的结构

研究人员在TFIIS、FACT、IWS1和SETD2存在的情况下，对完整的哺乳动物激活延伸复合物进行了生化和结构分析。通过将复合物停滞在已知会触发核小体转移到Pol II上游的位置，他们获得了称为State 1的冷冻电镜结构。

在State 1中，FACT结合转移的六聚体(缺失一个H2A-H2B二聚体的核小体)，位于Pol II活性中心上方的上游DNA区域。延伸因子DSIF(SPT4/SPT5)和SPT6很好地稳定了FACT结合的上游六聚体。与典型的完整激活延伸复合物相比，SPT6向上游DNA旋转约20°，提供了延伸复合物和六聚体之间的额外接触点。

研究人员还发现RTF1的一个螺旋区域(命名为FACT"紧固件")与SPT16直接相互作用，这可能在转录过程中帮助将FACT结合的核小体保留在Pol II附近。重要的是，研究团队在SPT6附近发现了未指派的密度，通过化学交联质谱数据和Colabfold预测，将其确定为SETD2的一个保守的7个氨基酸片段(命名为SPT6结合区SBR)。

近端H3K36me3写入复合物的结构

为了研究SETD2如何甲基化完整的上游核小体，研究人员在连接核小体模板上重建了甲基化能力延伸复合物，获得了State 2结构。与State 1中观察到的上游六聚体相比，在State 2中催化SET结构域现在结合到SHL-1位置的近端H3尾巴。与先前催化SET结构域结合核小体的结构不同，在State 2中，SPT16的CTD稳定了SETD2结合的部分解缠绕的核小体。

多体细化分析揭示了上游核小体相对于Pol II的取向，表明持续转录将使核小体重新组装并定位于Pol II的上游边缘。FACT从核小体二分体解离，但保持松散束缚以稳定部分解缠绕的核小体状态。SETD2被束缚在SPT6上，使得自抑制域(AID)不会阻止催化SET结构域与核小体的近端H3尾巴结合。

远端H3K36me3写入复合物的结构

为了甲基化上游核小体的两个H3尾巴，SETD2需要在转录过程中接近近端和远端H3组蛋白尾巴。研究人员在延长15bp的连接核小体模板上准备了另一个复合物，获得了State 3结构。

在产生的State 3结构中，SETD2结合到SHL+1位置的远端H3尾巴。额外的15bp DNA诱导约20bp的DNA重新包裹核小体，使近端H3尾巴对SETD2结合不可及。SETD2结合远端H3尾巴促进了远端DNA解缠绕至约SHL+4.5。远端H3K36me3复合物的整体结构分析表明，核小体重新包裹使核小体旋转了约45°，将SETD2定位在SPT6的相对侧，同时保持SETD2和SPT6之间的相互作用。

SETD2-SPT6相互作用是H3K36me3沉积所必需的

在结构观察的基础上，研究人员通过功能实验验证了SPT6-SETD2相互作用的重要性。共转录甲基化实验表明，省略SPT6会使甲基化活性降低约75%，而删除SPT6的DLD结构域会导致活性降低约40%。转录活性分析表明，甲基化缺陷是由DLD缺失直接引起的，而非间接通过影响转录过程。

SETD2截断实验进一步证实了SBR功能的重要性。仅包含催化SET结构域的结构显示比野生型高近三倍的甲基化水平，而添加AID则完全废除甲基化。包含完整SBR的较长SETD2变体恢复了约50%的甲基化活性，突出了完整SBR对SETD2活性的重要性。

后生动物特有的SETD2自抑制域酸性插入调控核小体结合

研究人员在SETD2的AID中发现了一个后生动物特有的170个氨基酸插入。去除该插入显著增加了SETD2在共转录甲基化实验中的活性，类似于未调控的单独SET结构域。电泳迁移率实验显示，去除酸性插入后与重构核小体的结合更紧密。分析性凝胶过滤证实了AID和SET结构域之间的直接相互作用，该相互作用可通过增加离子强度破坏。这些结果表明，酸性插入是后生动物SETD2 AID中的一个关键调控元件。

讨论与意义

本研究提出了共转录H3K36me3沉积的三步模型。第一步，SETD2通过SBR与SPT6结合，将催化SET结构域定位到Pol II的上游边缘。第二步，Pol II通过核小体的转录伴随着FACT介导的核小体从下游到上游DNA的转移，将六聚体定位在SETD2的AID附近，重新定向该结构域从而克服自抑制。第三步，进一步转录使FACT沉积缺失的H2A-H2B二聚体并稳定部分解缠绕的核小体，让催化SET结构域结合并甲基化近端H3尾巴；随后转录使DNA重新包裹近端组蛋白，重新定位SETD2至远端H3尾巴，完成转录核小体上的H3K36me3沉积。

该机制类似于共转录RNA转录本修饰(如前mRNA加帽和剪接)，也涉及与Pol II相关通用延伸因子的相互作用。研究还指出，除了H3K36me3之外，其他组蛋白尾部修饰也是共转录引入的，包括组蛋白H2B第120位赖氨酸的泛素化(H2BK120ub¹)、组蛋白H3第4位赖氨酸的三甲基化(H3K4me³)和H3第79位赖氨酸的甲基化(H3K79me³)。进行这些修饰所需的某些酶与磷酸化CTD或Pol II延伸因子相互作用，它们是否也在核小体转移到转录Pol II的后方后引入，以及哪些相互作用基础调控它们，仍有待研究。

这项研究由James L. Walshe和Moritz Ochmann等人完成，通讯作者为Patrick Cramer，工作单位是德国马克斯·普朗克多学科科学研究所。该研究不仅揭示了SETD2介导的H3K36me3沉积的精确分子机制，还为理解转录与表观遗传修饰之间的耦合提供了重要见解，对癌症等疾病的研究具有深远意义。