索拉非尼通过调控CX3CL1/CX3CR1轴抑制犬移行细胞癌中髓源性抑制细胞浸润的作用机制研究

《Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice》：Sorafenib inhibits myeloid-derived suppressor cell infiltration in canine transitional cell carcinoma

本研究针对犬移行细胞癌（cTCC）缺乏有效疗法的现状，探讨了多激酶抑制剂索拉非尼通过调控CX3CL1/CX3CR1信号轴抑制髓源性抑制细胞（MDSCs）浸润的免疫调节机制。研究发现索拉非尼通过抑制VEGF-A/PDGF-bb介导的MAPK通路下调肿瘤细胞CX3CL1表达，从而阻断MDSCs向肿瘤组织的趋化浸润。该研究首次揭示了CX3CL1/CX3CR1轴作为cTCC免疫治疗新靶点的潜力，为开发联合免疫疗法提供了理论依据。

　　

在犬类肿瘤中，移行细胞癌（Transitional Cell Carcinoma, TCC）虽然仅占所有肿瘤的1%-2%，但其恶性程度高、早期诊断困难，确诊时多已发生侵袭转移。传统化疗方案的中位生存期不足一年，且易产生耐药性，这促使科研人员不断探索新的治疗策略。近年来，肿瘤免疫治疗成为研究热点，其中髓源性抑制细胞（Myeloid-Derived Suppressor Cells, MDSCs）作为具有免疫抑制功能的未成熟细胞，在肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中扮演了“帮凶”角色，与不良预后密切相关。然而，针对MDSCs的特异性调控手段仍十分有限。多激酶抑制剂索拉非尼（Sorafenib）已知能靶向VEGFR（血管内皮生长因子受体）、PDGFRβ（血小板衍生生长因子受体β）等酪氨酸激酶，并具有调节免疫细胞的潜力，但其在犬TCC（cTCC）中影响MDSCs的具体机制尚不明确。研究人员推测，索拉非尼可能通过影响肿瘤细胞产生的趋化因子来调控MDSCs的募集，从而改善肿瘤免疫抑制状态。

为了验证这一假说，研究团队开展了一项系统的机制探索。本研究主要运用了以下几种关键技术方法：首先，建立了cTCC细胞系（Sora, Love, MCTCC, LCTCC, TCCUB）的体外模型以及cTCC细胞在小鼠体内的异种移植模型；其次，通过RNA测序（RNA sequencing）技术筛选索拉非尼处理后cTCC细胞中差异表达的趋化因子；第三，利用蛋白质印迹（Western blotting）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、实时定量PCR（qRT-PCR）和免疫组织化学（Immunohistochemistry）等技术在分子和蛋白水平检测CX3CL1等的表达；第四，通过Transwell实验分析MDSCs的体外趋化能力；第五，采用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建CX3CL1基因敲除（Knockout, KO）的cTCC细胞系；第六，利用流式细胞术（Flow cytometry）分析小鼠模型不同组织（脾脏、外周血单核细胞、骨髓、肿瘤组织）中MDSCs的比例及其表面CX3CR1受体的表达。临床样本方面，研究纳入了56只患有TCC的犬只，收集其血清、尿液和组织样本，并与健康犬只进行比较。

3.1. 索拉非尼对cTCC移植小鼠模型肿瘤组织中MDSCs的影响

研究人员在构建cTCC异种移植小鼠模型后，给予索拉非尼或Vehicle（载体）口服治疗14天。流式细胞术分析显示，Vehicle组小鼠肿瘤组织中Gr-1⁺ CD11b⁺的MDSCs平均占总细胞的3.4%，而索拉非尼治疗组MDSCs的比例显著下降至0.4%。这表明索拉非尼能有效抑制MDSCs在cTCC肿瘤组织中的浸润。

3.2. 索拉非尼处理后cTCC细胞系中趋化因子的表达

为了探究索拉非尼抑制MDSCs的机制，研究人员对5种cTCC细胞系进行RNA测序，分析索拉非尼处理后趋化因子表达的变化。结果发现，CX3CL1和CXCL10的表达在索拉非尼处理后显著下调。进一步的qPCR验证证实，索拉非尼能降低所有5种cTCC细胞系中Cx3cl1的mRNA表达。蛋白质印迹和ELISA实验也表明，索拉非尼以剂量依赖的方式降低了cTCC细胞中CX3CL1的蛋白表达及其在培养上清液中的浓度。在动物模型中，索拉非尼治疗组小鼠肿瘤组织的Cx3cl1mRNA表达也显著低于Vehicle组。这些结果确定了CX3CL1是索拉非尼下游的一个关键下调分子。

3.3. VEGF-A和PDGF-BB重组蛋白刺激以及联合MAPK通路抑制剂对CX3CL1表达的影响

由于索拉非尼靶向VEGFR2和PDGFRβ，研究团队用其配体VEGF-A和PDGF-BB重组蛋白刺激cTCC细胞，发现两者均能上调CX3CL1的表达。接下来，他们探讨了VEGFR2和PDGFRβ下游的MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）通路是否参与调控。使用ERK1/2、JNK、p38和MEK1/2的特异性抑制剂进行干预，发现ERK1/2、JNK和MEK1/2抑制剂能够抑制VEGF-A诱导的CX3CL1上调；而所有测试的MAPK通路抑制剂均能抑制PDGF-BB诱导的CX3CL1表达增加，其中ERK1/2抑制剂效果最为显著。这表明VEGF-A/PDGF-BB通过MAPK通路（尤其是ERK1/2）调控CX3CL1的表达。

3.4. cTCC病例血清和尿液中CX3CL1、VEGF-A和PDGF-BB的水平

对临床样本的分析显示，与健康犬相比，cTCC患犬的尿液CX3CL1和VEGF-A浓度显著升高，而血清中两者水平无显著差异。PDGF-BB在血清和尿液中的浓度在两组间无显著差异。相关性分析发现，cTCC患犬尿液中CX3CL1与VEGF-A浓度呈正相关，但与PDGF-BB无相关性。这提示在cTCC中，VEGF-A信号通路可能与CX3CL1的表达调控存在关联。

3.5. cTCC病例肿瘤组织中的CX3CL1表达

免疫组织化学染色显示，健康犬膀胱移行上皮细胞仅有弱CX3CL1染色，而大多数cTCC肿瘤组织中的肿瘤细胞呈现中度至强度的CX3CL1阳性染色，其染色评分显著高于正常组织。这表明CX3CL1在cTCC肿瘤组织中高表达。

3.6. BRAF^V595E突变与cTCC病例中CX3CL1表达的关联

分析显示，在BRAF野生型和BRAF^V595E突变型cTCC病例的血清、尿液和肿瘤组织中均可检测到CX3CL1，但两组间的表达水平无显著差异。这表明CX3CL1的表达可能不依赖于cTCC中常见的BRAF^V595E突变。

3.7. MDSCs上CX3CR1的表达及对CX3CL1的趋化性

流式细胞术检测发现，cTCC移植小鼠肿瘤组织中的MDSCs以及cTCC患犬外周血单核细胞中的PMN-MDSCs（多形核MDSCs）和M-MDSCs（单核细胞样MDSCs）均表达CX3CL1的特异性受体CX3CR1。Transwell趋化实验进一步证明，重组CX3CL1蛋白能以剂量依赖的方式吸引来自小鼠脾脏的MDSCs发生迁移，同样也能促进cTCC患犬来源的PMN-MDSCs和M-MDSCs的迁移。这表明MDSCs表面表达的CX3CR1能介导其对CX3CL1的趋化反应。

3.8. CX3CL1敲除对cTCC小鼠模型肿瘤生长和MDSCs的影响

利用CRISPR-Cas9技术成功构建了CX3CL1敲除（KO）的cTCC细胞系。体外细胞增殖实验表明，CX3CL1敲除并不影响肿瘤细胞自身的增殖。值得注意的是，cTCC细胞系本身不表达CX3CR1受体，排除了CX3CL1通过自分泌作用直接影响肿瘤细胞的可能性。在动物实验中，植入CX3CL1 KO细胞的荷瘤小鼠，其肿瘤体积和重量均显著小于植入Scramble（ scramble 序列作为对照）控制细胞的小鼠。流式分析显示，CX3CL1敲除并未影响脾脏、外周血单核细胞和骨髓中的MDSCs比例，但却显著降低了肿瘤组织内MDSCs的浸润数量。这直接证明肿瘤细胞来源的CX3CL1对于MDSCs募集至肿瘤局部至关重要，且其缺失能抑制肿瘤生长。

3.9. CX3CR1抑制剂对cTCC小鼠模型肿瘤生长和MDSCs的影响

为了验证靶向CX3CL1/CX3CR1轴的治疗潜力，研究人员在cTCC移植小鼠模型中使用CX3CR1抑制剂（JMS17-2）进行干预。结果显示，与Vehicle对照组相比，CX3CR1抑制剂治疗显著抑制了肿瘤的生长，降低了肿瘤体积和重量，且未观察到明显的副作用。与基因敲除结果一致，抑制剂处理并未改变脾脏、外周血单核细胞和骨髓中的MDSCs比例，但特异性地减少了肿瘤组织中的MDSCs数量。这从药理学角度证实，阻断CX3CR1信号通路能够抑制MDSCs的肿瘤浸润，从而发挥抗肿瘤作用。

研究结论与意义

本研究系统地阐明了索拉非尼在犬移行细胞癌中一种新的免疫调节机制：索拉非尼通过抑制其靶点VEGFR2和PDGFRβ，进而阻断下游MAPK信号通路（特别是ERK1/2），导致肿瘤细胞产生趋化因子CX3CL1的能力下降。由于MDSCs表达CX3CL1的受体CX3CR1，并对CX3CL1具有趋化性，CX3CL1的减少直接削弱了MDSCs向肿瘤组织的募集。研究进一步通过基因敲除和药理学抑制两种方法证明，干扰CX3CL1/CX3CR1轴能够有效减少肿瘤内MDSCs的浸润，并抑制肿瘤生长。

该研究的创新性在于首次在cTCC模型中揭示了CX3CL1/CX3CR1轴在招募MDSCs中的关键作用，并将索拉非尼的抗肿瘤效应与其调节该趋化因子轴的能力联系起来。这不仅深化了对多激酶抑制剂免疫调节功能的理解，也为cTCC乃至人类膀胱癌（两者在病理特征和BRAF突变等方面有相似之处）的免疫治疗提供了新的潜在靶点。针对CX3CL1/CX3CR1轴的干预策略，未来或可与现有的免疫检查点抑制剂等疗法联合应用，以期克服MDSCs介导的免疫抑制，改善治疗效果。尽管本研究存在样本量、模型局限性等不足，但其发现为开发针对肿瘤免疫微环境的联合治疗策略奠定了重要的理论基础，具有显著的转化医学价值。