肠道缺氧激活CRISPR-Cas免疫：揭示肠杆菌科细菌在宿主体内的适应性防御机制

《Nature Microbiology》：Anoxia activates CRISPR–Cas immunity in the mouse intestine

本研究针对肠杆菌科细菌CRISPR-Cas系统的天然调控机制这一长期悬而未决的问题，通过研究Citrobacter rodentium在缺氧肠道环境中的免疫应答，发现其I-E型CRISPR-Cas系统受氧敏感转录调节因子Fnr激活。该调控机制在41%的肠杆菌科cas3直系同源物中存在，表明缺氧调控CRISPR-Cas免疫是肠杆菌科在肠道微生物群中抵御外源DNA威胁的重要适应性策略。

　　

在微生物与宿主的共生关系中，细菌如何精准调控其免疫系统以适应复杂多变的肠道环境一直是微生物学领域的核心问题。CRISPR-Cas系统作为原核生物抵御外源遗传元件的适应性免疫系统，其分子机制已被深入解析，然而这些系统在天然环境尤其是哺乳动物肠道中的调控规律却鲜为人知。肠杆菌科作为肠道微生物群的重要组成部分，其CRISPR-Cas系统在实验室标准有氧条件下往往保持沉默状态，这种“静默”现象严重阻碍了对其生理功能的认知。研究者们迫切需要揭示：在真实的肠道微环境中，是什么信号激活了这套精密的防御系统？这种激活又对细菌的生存竞争有何意义？

为解决这一科学难题，哈佛医学院Matthew K. Waldor团队以天然感染小鼠的病原体Citrobacter rodentium为模型，开展了一系列创新性实验。研究人员首先通过RNA测序技术比较了细菌在缺氧与有氧条件下的转录组差异，发现缺氧能显著激活cas基因座的表达。为验证这种转录激活是否转化为功能性免疫，团队设计了精妙的质粒保留实验——通过监测含有CRISPR识别序列的靶质粒与对照质粒的保留频率，直观反映CRISPR-Cas系统的切割活性。

关键技术方法包括：利用RNA测序分析转录组变化；建立质粒保留实验评估CRISPR-Cas活性；应用InducTn-seq转座子突变库进行功能缺失筛选；通过qPCR验证基因表达调控；采用生物信息学方法分析Gammaproteobacteria中cas3上游的Fnr结合位点保守性；使用小鼠肠道感染模型评估体内免疫活性。

缺氧特异性激活CRISPR-Cas免疫

在固态LB琼脂上培养3.5小时后，RNA测序显示缺氧条件下cas基因座的转录本数量显著高于有氧条件。功能实验进一步证实：在有氧培养时，92%的细胞保留靶质粒，表明CRISPR-Cas免疫处于失活状态；而在缺氧条件下，仅1%的细胞保留靶质粒，证明缺氧能特异性激活免疫应答。缺失整个cas基因座(Δcas3-2)的突变体在缺氧条件下完全丧失质粒清除能力，确认该现象依赖于完整的CRISPR-Cas系统。

Fnr是缺氧调控的关键转录因子

通过InducTn-seq筛选系统，研究人员在携带靶质粒的转座子突变体库中，发现fnr基因及其伴侣蛋白hscA的插入突变体在缺氧培养后显著富集。fnr编码的氧敏感转录调节因子在兼性厌氧菌中高度保守。缺失fnr(Δfnr)或突变cas3上游69.5核苷酸处的Fnr结合位点，均完全消除CRISPR-Cas免疫活性。qPCR实验进一步显示，Fnr结合位点的突变阻断了cas3对缺氧的转录应答，证实Fnr直接激活CRISPR免疫。

Fnr调控在Gammaproteobacteria中广泛保守

对501个含cas3直系同源物的Gammaproteobacteria基因组进行 motif 富集分析，发现141个基因组在cas3上游存在预测的Fnr结合位点。这些基因组分布於Gammaproteobacteria的大多数目级分类单元中，且肠杆菌科的Fnr结合位点与大肠杆菌MG1655菌株中定义的Fnr共识序列高度匹配。在32个肠杆菌科基因组中，13个存在位置保守的Fnr结合 motif，提示Fnr依赖性cas3激活在该科细菌中具有进化保守性。

肠道内缺氧激活CRISPR-Cas免疫

从感染C57BL/6J小鼠7天后分离的粪便相关C. rodentium中，cas基因座的转录水平显著高于有氧培养条件。更重要的是，体内实验显示：感染初期，大多数排出的细菌保留靶质粒；随后野生型C. rodentium逐渐丢失质粒，接种13天后仅1%的细菌保留质粒。相比之下，Δcas3-2突变体有85%的细胞保留质粒，Δfnr突变体有23%的细胞保留质粒，证明肠道内的缺氧环境通过Fnr依赖性机制激活CRISPR-Cas免疫。

讨论与意义

本研究首次揭示了缺氧作为关键环境信号，通过Fnr转录调节因子激活肠杆菌科CRISPR-Cas系统的分子机制。肠道作为低氧环境且富含微生物和噬菌体的生态位，缺氧调控CRISPR-Cas免疫代表了一种重要的适应性策略，使肠杆菌科细菌能够在这一竞争激烈的环境中抵御外源遗传元件入侵。Δcas3-2与Δfnr突变体在体内实验中的表型差异提示，除缺氧外，肠道内可能还存在其他信号（如H-NS介导的转录抑制解除）共同调控CRISPR活性。该发现不仅解决了肠杆菌科CRISPR-Cas系统天然调控的长期谜题，也为理解细菌免疫系统在宿主环境中的进化适应提供了新视角。由于Fnr调控机制在41%的肠杆菌科中保守存在，这一发现对理解肠道微生物群的生态平衡和细菌-噬菌体互作具有广泛意义。