基于RPA-CRISPR/Cas13a/Cas13b的马动脉炎病毒与非洲马瘟病毒双实时可视化检测新方法

《Microchemical Journal》：A dual real-time visualization detection of equine arteritis virus and African horse sickness virus based on RPA-CRISPR/Cas13a, Cas13b

本文开发了一种结合重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR-Cas13a/13b的双重检测平台，可在单管中1小时内实现马动脉炎病毒（EAV）和非洲马瘟病毒（AHSV）的高灵敏度（检测限102拷贝/μL）及高特异性检测。该方法通过荧光信号可视化结果，与qPCR检测结果一致率达100%，为马病原体现场快速诊断提供了创新工具。

　　

Highlight

本研究首次建立了马动脉炎病毒（EAV）的RPA-CRISPR/Cas13a检测方法和非洲马瘟病毒（AHSV）的RPA-CRISPR/Cas13b检测方法，并进一步开发出整合Cas13a与Cas13b的双重检测平台，实现单管双靶标同步检测。该方法在1小时内完成检测，灵敏度高达10²拷贝/μL，且与其他马源病毒无交叉反应。在模拟马鼻拭子样本中验证显示，与实时荧光定量PCR（qPCR）结果完全一致。

Materials

本研究所用EAV活病毒及马鼻拭子样本由上海海关动植物与食品检验检疫技术中心提供。病毒DNA/RNA提取采用MagaBio plus纯化试剂盒；RPA引物与crRNA由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；ROX/BHQ-2标记的ssRNA报告探针购自金斯瑞生物科技；LwaCas13a与PsmCas13b酶为实验室自制。

Establishment and evaluation of EAV RPA-CRISPR/Cas13a and AHSV RPA-CRISPR/Cas13b detection methods

RPA扩增后的EAV产物通过CRISPR/Cas13a系统检测，AHSV产物则通过Cas13b系统检测。实验证实，仅当反应体系包含靶标、Cas13酶、crRNA及报告探针时才会触发荧光信号。ssRNA-FQ探针在蓝光下发射绿色荧光，ssRNA-RQ在红光下发射红色荧光，实现结果可视化判读。

Discussion

EAV与AHSV分别引起马动脉炎和非洲马瘟，对马健康构成严重威胁。当前检测方法存在耗时长、操作复杂等局限。本研究将RPA的快速扩增优势与CRISPR-Cas系统的高特异性结合，成功构建的双重检测平台为马病现场筛查提供了高效解决方案。

Conclusions

本研究建立的RPA-CRISPR/Cas13a/13b双检测平台兼具快速、灵敏、特异性强等优点，适用于实验室及野外场景下的马病原体即时检测，对保障马群健康及国际马术赛事可持续发展具有重要意义。