综述：CRISPR-Cas系统：开创寄生虫病下一代诊断工具的新纪元

本综述系统阐述了CRISPR-Cas系统作为分子诊断变革性工具在寄生虫病检测中的应用。文章详述了其发展历程、分类（Class 1/2，Types I–VI）、分子机制，并重点分析了其与等温扩增技术（如LAMP、RPA）联用实现的高灵敏度、特异性及现场快速检测（POC）潜力。尽管面临脱靶效应等挑战，但结合纳米技术、微流控等前沿方向，CRISPR-Cas技术为人类与兽医寄生虫病的精准防控开辟了新前景。

　　

Abstract

寄生虫病对人类和动物健康构成重大威胁，传统诊断方法如显微镜检查、血清学和聚合酶链式反应（PCR）存在灵敏度低、交叉反应性或依赖昂贵设备等局限。等温扩增技术（如LAMP、RPA）改善了现场应用，但仍受非特异性扩增和低拷贝靶标灵敏度不足的制约。成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及相关蛋白（Cas）系统已成为分子诊断的变革性工具，以其高灵敏度、特异性、快速和成本效益而著称。本综述概述了CRISPR-Cas系统、其历史发展、分类（Class 1和Class 2，Types I–VI）、分子机制及其在寄生虫病中的诊断潜力，并列举了2017年至2025年5月期间发表的研究实例。尽管进展显著，但基于CRISPR的诊断方法仍面临脱靶活性、依赖核酸扩增和复杂样品制备等挑战。未来方向聚焦于无扩增检测、多重检测开发以及与纳米技术、微流控、基于智能手机的设备及人工智能的集成。因此，CRISPR-Cas技术代表了人类和兽医健康中寄生虫病监测、控制和个性化医疗下一代诊断的新前沿。

Introduction

寄生虫病给动物健康和畜牧业生产力带来沉重负担，尤其在热带和亚热带地区。传统诊断方法各有局限：显微镜灵敏度低；血清学检测存在交叉反应性；PCR需要热循环设备和专业实验室。等温扩增技术（IATs）如环介导等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）等，虽简化了操作，但仍存在非特异性扩增等问题。CRISPR-Cas系统，最初在原核生物中发现作为适应性免疫机制，已被重新用于分子诊断，其简单性和低基础设施要求使其非常适合现场（POC）应用。在寄生虫学中，此类平台对于检测低丰度寄生虫核酸至关重要。通常，CRISPR系统会与核酸扩增方法（如PCR或IATs）结合使用，以实现飞摩尔甚至阿摩尔水平的检测灵敏度，这对于亚临床病例的早期检测和流行病学监测具有重要意义。

History of CRISPR-Cas systems

CRISPR-Cas系统最早在20世纪80年代在大肠杆菌中被发现为重复DNA序列。随后的研究在其他细菌和古菌中也发现了类似序列。2002年，Jansen等人首次正式使用CRISPR术语并描述了相关的Cas基因。该系统的免疫机制，特别是CRISPR RNA（crRNA）引导防御的功能逐渐被阐明，为其后续应用于基因编辑和诊断奠定了坚实基础。

CRISPR-Cas systems

CRISPR-Cas系统是高度复杂的适应性免疫机制，存在于约45%的细菌和83%的古菌基因组中。它们通过识别和降解外来核酸（如噬菌体、质粒）来提供防御。基于其效应物复合物的结构，CRISPR-Cas系统主要分为Class 1（多亚基效应复合物，如Type I, III, IV）和Class 2（单蛋白效应物，如Type II的Cas9, Type V的Cas12, Type VI的Cas13）。Class 2系统因其操作简便性而在诊断应用中占主导地位。

Steps in CRISPR-Cas based diagnostics assay

基于CRISPR-Cas的诊断平台工作流程通常包括五个基本阶段：核酸提取、靶标核酸预扩增（通常使用RPA、LAMP等技术）、CRISPR-Cas检测（Cas效应物在crRNA引导下识别特定靶序列并激活其切割活性）、信号转导（利用Cas12/Cas13等的附带切割活性切割报告分子产生可检测信号）以及结果判读（可通过荧光、侧流层析试纸条或比色法读取）。

CRISPR-Cas based diagnosis

在寄生虫病诊断中，Class 2系统应用最为广泛。Cas9可用于特异性切割和检测。Cas12（如Cas12a）和Cas13（如Cas13a）因其强大的附带切割活性（反式切割）而备受青睐，能够高效切割报告分子，显著放大检测信号，实现超高灵敏度检测，已成功应用于疟原虫、利什曼原虫、弓形虫等多种重要寄生虫的检测。Class 1系统（如基于Cas3、Cas10的系统）虽然研究较少，但其多蛋白效应复合物和附带切割活性也显示出诊断潜力。

Key conclusions

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  CRISPR-Cas作为变革性工具： CRISPR-Cas系统通过结合可编程性、高特异性和快速出结果，重新定义了分子诊断，在寄生虫病检测中价值显著。
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  Class 2系统占主导地位： Type II (Cas9)、Type V (Cas12) 和 Type VI (Cas13) 因其单效应物特性、可编程向导RNA以及Cas12/Cas13强大的附带切割活性（增强信号放大）而得到最广泛应用。
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  高灵敏度与POC潜力： 与等温扩增技术（RPA、LAMP等）结合，可实现极低拷贝数靶标的检测，非常适合现场快速诊断（POC）和资源有限地区。
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  挑战与未来方向： 当前挑战包括脱靶活性、对预扩增的依赖以及复杂样品制备。未来研究将集中于无扩增检测、多重检测开发，以及与纳米技术、微流控、智能手机设备和人工智能的集成。

CRediT authorship contribution statement

（此处省略贡献声明具体内容，因其主要为作者角色描述，非综述科学内容）

Declaration of Competing Interest

作者声明无已知竞争性财务利益或个人关系。

Acknowledgments

本研究得到了印度政府阿努桑丹国家研究基金会（ANRF）的资助。作者感谢所在机构提供的支持。