《Journal of Molecular Graphics and Modelling》：Formulation of papain-synthetic oligopeptide O(F-r-E) and O(F-r
K) for enhancing pH tolerance of high internal phase emulsions
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本研究通过木瓜蛋白酶催化合成两亲性寡肽（F-r-E/K），优化其组成（F/E/K摩尔比1.42/5.25和2.77/3.04），制备出分子量分布窄（PDI<1.1）的寡肽。实验表明，混合寡肽对含75-85%角鲨烯的HIPEs具有超过6个月的稳定性（pH1/11），显著优于单一寡肽。分子动力学模拟证实pH依赖的离子化状态影响界面吸附，验证了酶促合成寡肽在极端pH条件下的稳定性优势。该策略为可持续食品和医药用HIPEs稳定剂开发提供了新途径。
本研究提出了一种利用木瓜蛋白酶催化合成两亲性寡肽的新方法，以在极端条件下稳定高内相乳液（HIPEs）。通过调整苯丙氨酸（F）与谷氨酸（E）或赖氨酸（K）底物的投料比例，研究人员成功合成了具有可控聚合度（5–6）和狭窄分子量分布（PDI?1.42-r-E
5.25)和O(F
2.77-r-K
3.04）稳定形成的HIPEs表现出卓越的长期稳定性，能够在pH值为1和11的极端环境下保持完整超过6个月。相比之下，使用单一寡肽的配方则迅速发生破乳现象。分子动力学模拟进一步证实了pH依赖的离子化状态对界面吸附行为具有显著影响。本研究强调了通过酶促合成的寡肽在需要在极端pH条件下实现强效乳液稳定性的应用中的巨大潜力。
### 引言
寡肽是由氨基酸单体通过肽键连接形成的寡聚物，通常由2到20个氨基酸组成，因此它们比多肽和蛋白质短得多。寡肽因其在生物功能、化学性质以及在生物化学和医学领域的广泛应用而受到广泛关注。两亲性肽或寡肽，也被称为肽表面活性剂，能够在液体界面自组装形成具有凝聚力的薄膜，从而稳定泡沫和乳液。在肽表面活性剂的研究中，大量信息涉及通过消化天然蛋白质获得具有潜在表面活性的短肽序列。蛋白酶解通常会产生比原始蛋白质具有更强乳化活性的肽，这一现象归因于界面结构的变化，如疏水性氨基酸的暴露增加。例如，酪蛋白水解肽已被用于高内相油相乳液（HIPE）的配方中。来自蛋高密度脂蛋白的酶促水解产物EHT被用于稳定玉米油和水的高内相乳液，如Liu等人所展示的。此外，肽表面活性剂可以通过基因工程进行设计和生物合成，Bruschi及其同事利用大肠杆菌BL21(DE3)作为表达宿主，通过基于pET48b(+)载体的pEDA生产肽表面活性剂，成功实现了超过6.5?g/L的重组肽产量。所生产的肽DAMP4具有氨基酸序列MD(PSMKQLADS-LHQLARQ-VSRLEHAD)
4，能够降低界面张力并稳定泡沫（气-水界面）和乳液（油-水界面）。与传统的HIPE稳定剂（如聚合物乳化剂和纳米颗粒）相比，两亲性肽或寡肽表现出更强的生物相容性和环境友好的合成特性。本研究进一步指出，寡肽能够自组装成纳米颗粒，从而结合了肽和纳米颗粒的优势。
### 合成方法
化学和酶促方法均可用于寡肽的合成。固相肽合成（SPPS）是一种基础方法，其中肽是在不溶性树脂上逐个构建的。这种方法便于控制组装过程，并能够生产从几个残基到更长链的肽。然而，蛋白酶催化的化学酶促合成方法相比其他过程具有显著优势，因为它可以在水环境中进行，并且不需要对氨基酸侧链进行保护。另一方面，利用蛋白酶如木瓜蛋白酶进行酶促合成具有诸多好处，包括温和的反应条件、选择性和符合“绿色”化学原则。木瓜蛋白酶是一种来源于木瓜果实（Carica papaya）的半胱氨酸蛋白酶，其对疏水性氨基酸残基具有偏好性。疏水性氨基酸单体，如L-苯丙氨酸（F），使通过蛋白酶合成的寡肽在水中不溶，从而在聚合过程中形成沉淀，并促使反应向肽形成的方向进行。这种特性还减少了不利反应（如转氨酰化和水解）的发生概率。沉淀的寡肽能够在水中形成不溶性寡肽纳米颗粒。Kim等人发现，含有苯丙氨酸-苯丙氨酸（FF）的寡肽能够在水溶液中形成聚集体，并通过π-π堆积自组装成纳米管。在Dittrich等人的研究中，发现当溶剂从乙醇更换为水时，疏水性10个氨基酸的肽会自组装成固体颗粒。蛋白酶催化的肽合成被认为是一种由动力学控制的过程。首先，活化的氨基酸与酶相互作用，形成酰基-酶中间体（ES复合物）。随后，该中间体通过亲核试剂（如氨基酸酯或水）进行竞争性脱酰基反应。
### HIPEs的特性与应用
高内相乳液（HIPEs）是一种特殊的乳液，其分散相（内相）体积分数超过74%，导致其呈现出高度粘稠、类似凝胶的特性，这与传统乳液在结构和稳定性需求上有显著差异。由于HIPEs的高内相体积和界面特性，它们在药物输送和食品工业中展现出广泛的应用潜力。然而，HIPEs的稳定性面临固有的挑战，因为其高表面积和分散相之间的紧密接触可能导致乳液的快速破乳。因此，需要高效的稳定剂，如经典表面活性剂、颗粒（形成Pickering乳液）、聚合物或肽。肽提取物由于其天然来源、生物相容性、营养价值和功能多样性，已被广泛研究作为HIPEs的稳定剂。蛋白质降解是一种重要的方法，用于生产能够稳定HIPEs的肽，因为肽具有低毒性、优良的乳化特性以及良好的生物降解性。然而，蛋白质本质上是异质的，导致其降解产物具有复杂的分子量分布和多样的氨基酸组成，这取决于所采用的提取方法。因此，蛋白质提取物的组成复杂性使得其在稳定HIPEs中的效果对提取过程的变化非常敏感。本研究采用酶促合成方法，生产了一系列由疏水性苯丙氨酸（F）和可离子化的谷氨酸（E）或赖氨酸（K）残基组成的两亲性寡肽。通过改变疏水性和亲水性氨基酸底物的类型和投料比例，研究人员能够调控寡肽的组成。这一方法提出了一种自下而上的策略，用于阐明寡肽的分子结构与其稳定HIPEs能力之间的关系。
### 材料
本研究中使用的木瓜蛋白酶（800?U/mg，蛋白质含量63.5%）由中国上海的Adamas Life公司提供。L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐（F-OMe·HCl，98%）、L-谷氨酸二乙酯盐酸盐（E(OEt)-OEt·HCl，98%）和L-赖氨酸甲酯盐酸盐（K-OMe·2HCl，98%）则由Adamas Reagent（上海，中国）提供。所有其他试剂均使用最高纯度的产品。
### 通过木瓜蛋白酶催化的O(F-r-E)和O(F-r-K)寡肽的合成与特性
木瓜蛋白酶作为一种半胱氨酸蛋白酶，在寡肽合成中展现出高度的生物催化活性。其催化活性来源于其活性中心中一个保守的三联体，包括半胱氨酸25（C25）、组氨酸159（H159）和天冬酰胺175（N175），这些基团能够在温和的反应条件下促进肽键的断裂和形成。木瓜蛋白酶能够适应多种底物，使其成为合成具有不同序列的寡肽的理想工具。本研究中，通过调整疏水性苯丙氨酸（F）底物与亲水性谷氨酸（E）或赖氨酸（K）底物的投料比例，成功合成了O(F-r-E)和O(F-r-K)寡肽。所合成的寡肽具有狭窄的分子量分布（PDI?1.42-r-E
5.25)和O(F
2.77-r-K
3.04）在极端pH条件下表现出显著的长期稳定性，能够在pH值为1和11的环境中保持完整超过6个月。相比之下，单一寡肽的配方则在短时间内发生破乳现象。这一结果表明，混合寡肽对在稳定HIPEs方面具有更大的优势。分子动力学模拟进一步揭示了pH依赖的离子化状态对界面吸附行为的显著影响。在酸性或碱性条件下，寡肽的离子化状态发生变化，从而影响其在界面的吸附能力。这种离子化状态的变化可能导致寡肽在界面形成更稳定的结构，从而增强HIPEs的稳定性。此外，研究还发现，寡肽的疏水性和亲水性残基的分布对乳液的稳定性具有重要影响。疏水性残基的暴露程度决定了寡肽在界面的吸附能力，而亲水性残基则影响其在水相中的溶解性。因此，通过调整底物的投料比例，研究人员能够优化寡肽的结构，以实现最佳的乳液稳定性。
### 生物相容性与降解性
本研究中使用的寡肽由苯丙氨酸（F）、谷氨酸（E）和赖氨酸（K）组成，这些氨基酸广泛存在于人体组织和食品中。Kapitanov等人发现，含有苯丙氨酸的化合物具有良好的生物降解性。Espinoza-González等人通过MTT和NR分析表明，两亲性聚（α-赖氨酸-共-苯丙氨酸）具有无细胞毒性的特性。Akagi等人则报道，由聚（γ-谷氨酸）作为亲水性主链和L-苯丙氨酸乙酯（L-PAE）作为疏水性侧链组成的两亲性接枝共聚物可以通过酶促方式降解。在我们之前的研究中，通过MTT实验评估了MPEG修饰的寡苯丙氨酸的细胞毒性，结果表明尽管含有人工合成的MPEG成分，该两亲性物质仍表现出良好的生物相容性。这些发现支持了通过酶促合成的寡肽在食品、制药或化妆品行业中的应用潜力。由于寡肽具有良好的生物降解性和生物相容性，它们能够安全地用于食品和药物输送系统，而不会对环境或人体造成负面影响。此外，寡肽的可降解性使其在使用后能够自然分解，减少对环境的污染。因此，本研究不仅为HIPEs的稳定提供了新的方法，也为开发可持续、环保的乳液稳定剂提供了重要的理论基础。
### 结论
本研究介绍了一种“自下而上”的方法，用于设计和合成作为可持续HIPE稳定剂的两亲性寡肽。通过调整疏水性苯丙氨酸（F）底物与亲水性谷氨酸（E）或赖氨酸（K）底物的投料比例，研究人员成功合成了O(F-r-E)和O(F-r-K)寡肽。这些寡肽具有狭窄的分子量分布（PDI?
