CD28介导的线性与平行共刺激信号通过CAR微簇协同调控CAR-T细胞功能

《Communications Biology》：CD28-mediated linear and parallel costimulatory signaling cooperatively regulate CAR-T cell functions via CAR-CD28 microclusters

本研究针对嵌合抗原受体(CAR)-T细胞治疗中第二信号传导机制不清的问题，通过高分辨率成像技术揭示了CD28介导的线性(通过CAR内CD28结构域)与平行(通过内源性CD28受体)共刺激信号在调控CAR-T细胞功能中的协同作用。研究发现蛋白激酶Cθ(PKCθ)在CD28CAR微簇中特异性富集且持续时间长，这种聚集与IL-2产生和体内肿瘤抑制密切相关。该研究为优化CAR设计提供了新思路，强调需同时考虑CAR内置共刺激域和内源性受体信号。

　　

在肿瘤免疫治疗的前沿领域，嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法作为过继免疫治疗的重要进展，已在多种血液肿瘤中展现出显著疗效。然而，这种革命性疗法仍面临诸多挑战：部分患者治疗后出现复发、对实体瘤疗效有限，以及CAR-T细胞在体内持久性不足等问题。这些临床瓶颈背后的关键科学问题在于我们对CAR-T细胞激活机制的认知尚不完善，特别是共刺激信号在调控CAR-T细胞功能中的精确作用。

传统T细胞的有效激活需要双重信号：第一信号通过T细胞受体(TCR)识别主要组织相容性复合体(MHC)呈递的抗原肽，而第二信号则由共刺激受体(如CD28)与其配体(CD80/CD86)结合提供。第二代CAR虽在CD3ζ链基础上加入了CD28或4-1BB等共刺激结构域，能直接诱导线性第二信号，但CAR-T细胞本身也表达内源性共刺激受体，可在肿瘤细胞表达相应配体时诱导平行第二信号。这两种信号如何协同调控CAR-T细胞功能，特别是它们在空间和时间上的动态变化，一直是领域内未解之谜。

为解决这一科学问题，东京医学大学免疫学部的Tetsushi Nishikawa等研究人员在《Communications Biology》上发表了最新研究成果。团队运用高分辨率分子成像技术，首次揭示了CD28介导的线性与平行共刺激信号通过CAR微簇协同调控CAR-T细胞功能的机制。他们发现，与磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)不同，蛋白激酶Cθ(PKCθ)在CD28CAR微簇中特异性、高强度且持久地聚集，这种聚集与白细胞介素-2(IL-2)产生和体内肿瘤抑制能力密切相关。更重要的是，内源性CD28信号可弥补ζCAR缺乏共刺激信号的不足，显著增强CAR-T细胞的抗肿瘤功能。

研究的关键技术创新点在于采用支持脂质双层(SLB)技术和实时成像系统，直观展现了CAR微簇与内源性CD28在免疫突触中的动态相互作用。这种方法使得研究人员能够精确分析信号分子在CAR-T细胞激活过程中的时空分布，为理解CAR信号转导提供了全新视角。

研究方法上，团队构建了表达HaloTag标记的CD28CAR、ζCAR或4-1BBCAR的小鼠T细胞，通过共聚焦显微镜和全内反射荧光(TIRF)显微镜实时观察CAR微簇形成及信号分子招募。利用SLB系统模拟抗原呈递表面，分析CAR与内源性CD28的共定位。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞因子分泌，体外细胞毒性实验评估杀伤能力，并建立荷瘤小鼠模型验证体内抗肿瘤效果。此外，还采用蛋白质印迹法分析信号通路激活，流式细胞术检测肿瘤浸润淋巴细胞表型。

CD28-CD80结合在免疫突触处招募PKCθ并增强IL-2产生而不提高细胞毒性

研究首先在天然T细胞中验证了CD28共刺激的特性。OT-I TCR转基因CD8⁺ T细胞与卵清蛋白257-264(OVA_257-264)预处理的EL-4细胞共培养后，CD28与其配体CD80的结合能显著延长PKCθ在T细胞-抗原呈递细胞(APC)界面的滞留时间，而PI3K的催化亚基p110δ虽在5分钟内聚集，但20分钟后即消失。在含CD80的SLB上，CD28与TCR共同形成TCR-CD28微簇，PKCθ与这些微簇紧密共定位，并在免疫突触中心形成环状结构。功能上，CD28-CD80结合显著提高了IL-2产量，但未增强体外细胞毒性，表明CD28共刺激主要调节细胞因子产生而非直接杀伤功能。

hCD19 CD28ζCAR在CAR微簇处招募PKCθ并增强IL-2产生而不提高细胞毒性

在CAR-T细胞中，hCD19 CAR与CD19结合后形成"CAR微簇"，表现出与TCR微簇相似的向心运动。比较ζCAR、CD28ζCAR和4-1BBCAR发现，PKCθ在CD28ζCAR-T细胞界面聚集最为显著，且与CAR微簇高度共定位。形成中央超分子激活簇(cSMAC)时，PKCθ最终积累在免疫突触中心。CD28ζCAR和4-1BBCAR均诱导更多IL-2产生，但三种CAR-T细胞的体外细胞毒性无差异，印证了天然T细胞中CD28共刺激的特点。

T细胞内源性CD28与CD28ζCAR共同形成微簇

内源性CD28在CAR-T细胞表面的表达为平行共刺激提供了基础。在CD80存在的条件下，内源性CD28与CAR共同形成"CAR-内源性CD28微簇"。免疫突触形成后期，CAR和内源性CD28微簇向中心迁移，在CD80存在时形成独特的牛眼或环状结构，类似于天然T细胞中TCR-CD28的组装模式。

PKCθ向CAR微簇的转位受CD28-CD80结合增强，与细胞因子产生协同

当ζCAR-T细胞与表达CD80的靶细胞结合时，PKCθ聚集程度与CD28ζCAR-T细胞相当，而CD28ζCAR-T细胞在CD80存在下PKCθ聚集进一步增强。CD28共刺激(无论是CAR内置还是内源性)显著提高IL-2和干扰素γ(IFNγ)产量，但不影响体外细胞毒性。信号通路分析显示，CD28-CD80结合增强Erk磷酸化，而CD28ζCAR的基础CD3ζ磷酸化水平较高，受CAR-hCD19结合进一步强化。

CD28介导的信号增强CAR-T细胞体内抗肿瘤效果

体内实验表明，第二代CAR的优越性依赖于共刺激信号。CD28ζCAR-T细胞抑制CD80阳性和阴性EL-4肿瘤细胞生长的效果均优于ζCAR-T细胞，且CD80表达进一步增强抑瘤效果。免疫组化显示，CD80阳性肿瘤中浸润的CD28ζCAR-T细胞数量明显增加。肿瘤浸润淋巴细胞分析发现，CD28ζCAR-T细胞中高表达肿瘤坏死因子α(TNFα)和IFNγ的CD8⁺ T细胞比例更高，而终端耗竭T细胞(Tex细胞，以TIM-3⁺Ly108^-为特征)在PD-1⁺效应CD8⁺ T细胞中的比例较低，说明CD28信号延缓了T细胞耗竭。

研究结论与讨论部分强调，通过先进成像系统比较CAR内置CD28信号与T细胞本身内源性CD28信号，揭示了二者在CAR-T细胞功能中的重要性。CD28共刺激通过招募PKCθ至CAR微簇，激活核因子κB(NF-κB)通路，从而增强细胞因子产生和体内抗肿瘤效果。与主要调控细胞增殖存活的PI3K不同，PKCθ的聚集强度和时间更能反映NF-κB激活水平，与细胞因子产生和肿瘤抑制直接相关。

研究还指出CAR与TCR信号组的差异：CAR激活需要更多抗原，且衔接蛋白LAT磷酸化较弱，但Zap70仍会聚集于CAR微簇。CD28ζCAR中使用CD28跨膜区，使得CD28胞内域与Lck结合基序的距离与内源性CD28相似，而CD3ζ与CD28胞内域串联可能导致与Lck的非典型结合，这提示CAR设计中需考虑结构因素对信号转导的影响。

此外，CD28共刺激不增强体外细胞毒性但显著改善体内抗肿瘤效果的现象说明，细胞毒性主要依赖DAG产生和Ca²⁺内流等基本机制，而细胞因子产生和T细胞持久性则更需要共刺激信号。肿瘤微环境中CD80/CD86表达水平可能显著影响CAR-T细胞疗效，这解释了临床结果的异质性。

该研究的深刻意义在于提出了CAR设计新理念：不仅要优化CAR内置共刺激域，还需综合考虑T细胞本身表达的共刺激和共抑制受体。特别是在CD80/CD86高表达的肿瘤微环境中，内源性CD28信号可能足以补偿或增强CAR-T细胞功能。分子成像为评估CAR-T细胞激活提供了客观数字化方法，有望指导新一代CAR的合理设计，从而改善疗效、减少毒性，推动CAR-T细胞疗法在更广泛疾病中的应用。