无转基因、经过基因编辑的卡文迪许香蕉（Musa acuminata，AAA）

《Plant Biotechnology Journal》：Transgene-Free, Gene-Edited Cavendish Bananas (Musa acuminata, AAA)

基因编辑、CRISPR/Cas9、瞬时编辑、无外源DNA整合、香蕉、白化表型、三等位敲除、选择压力、T-DNA、监管宽松

　　这项研究聚焦于一种新型的基因编辑技术，特别针对香蕉品种Cavendish（如Williams和Grand Nain）进行改良。传统的基因编辑方法常常涉及将外源DNA整合到宿主基因组中，这在农业上可能引发监管限制和公众接受度的问题。为此，研究团队开发了一种无需外源DNA整合的基因编辑系统，旨在创建无转基因的基因编辑香蕉植株。该系统利用了Agrobacterium介导的瞬时基因编辑策略，结合了正向抗生素选择和负向选择机制，以筛选出不含整合T-DNA的编辑植株。

在实验中，研究者选择了两个与类胡萝卜素生物合成相关的内源基因作为目标：phytoene desaturase（pds）和lycopene β-cyclase（LCYb）。这些基因的编辑不仅有助于可视化基因编辑的效果，还能对香蕉的营养成分和抗病性产生积极影响。例如，pds基因的编辑会导致类胡萝卜素合成受阻，使植株呈现白化现象；而LCYb基因的编辑则会促使番茄红素在细胞中积累，导致细胞呈现粉红色。这种视觉标记对于快速评估基因编辑的成功与否具有重要意义。

为了实现这种瞬时编辑，研究团队设计了一种包含codA:nptII基因融合的T-DNA表达载体。在正向选择阶段，这些细胞会在48小时内受到抗生素卡那霉素的筛选，从而富集含有T-DNA的细胞。而在负向选择阶段，当细胞被5-FC处理时，由于codA酶的作用，会将5-FC转化为有毒的5-FU，导致含有T-DNA的细胞死亡。这种策略有效避免了外源DNA的长期存在，使得最终的基因编辑植株可能不携带任何转基因成分。

在实验中，研究者对多个基因编辑植株进行了分析。对于pds基因的编辑，共生成了32株植株，其中8株被证实含有编辑，并且极有可能不含整合的T-DNA。而针对LCYb基因的编辑，则生成了125株植株，其中34株被证实含有编辑。这些数据表明，该瞬时编辑系统在生成无整合DNA的基因编辑植株方面具有较高的效率，分别为17.6%至21.9%。

研究还发现，某些基因编辑植株可能包含不同的编辑类型，如小的插入或缺失、较大的删除，甚至是基因序列的倒置。这些不同的编辑类型在不同植株中呈现出不同的表型特征，例如白化植株或粉红色的细胞团。值得注意的是，某些植株虽然显示了编辑的迹象，但并未显示出明显的表型变化，这可能是因为编辑的基因并未对植株的表型产生显著影响，或者是因为编辑的基因在基因组中存在多个拷贝，部分拷贝被保留下来。

此外，为了验证这些基因编辑植株是否确实不含整合的T-DNA，研究者采用了靶向基因组测序和PCR筛查相结合的方法。通过对基因组DNA的分析，研究团队能够确认这些植株是否真正实现了无转基因的基因编辑。同时，他们还通过全基因组测序（WGS）进一步验证了编辑的完整性，并排除了外源DNA的存在。

该研究的意义在于，它为香蕉的基因改良提供了一种更为灵活和高效的策略。通过瞬时编辑技术，研究人员可以在不引入外源DNA的情况下，对目标基因进行精准的编辑。这不仅有助于规避转基因作物可能面临的监管障碍，还能够提高公众对基因编辑技术的接受度。此外，该方法还可以用于其他香蕉品种或相关作物的改良，从而推动农业上的可持续发展。

在实验过程中，研究者还对编辑后的植株进行了详细的表型和基因型分析。他们发现，一些植株虽然经历了基因编辑，但并未表现出显著的表型变化，这可能是因为编辑的基因在植物体内并未发挥关键作用，或者是因为编辑过程并未完全实现预期的基因功能丧失。然而，对于那些确实表现出白化或粉红色的植株，其基因编辑的效率较高，并且更有可能不含整合的T-DNA。

该研究还强调了瞬时编辑技术相较于传统稳定转化技术的优势。传统方法通常需要长期的抗生素筛选，这可能会对植物细胞的生长产生抑制作用，而瞬时编辑则采用较短的抗生素选择窗口，从而提高了编辑效率并减少了对植物生长的干扰。同时，由于没有外源DNA的长期存在，这种技术能够显著降低转基因作物可能带来的生态风险。

总的来说，这项研究展示了一种创新的基因编辑策略，能够有效提高香蕉基因改良的效率，并确保最终植株不含转基因成分。通过这种方法，研究人员能够探索更多的基因编辑可能性，为香蕉的农业改良和生物技术应用开辟了新的途径。该方法的实施不仅有助于应对香蕉种植过程中面临的病害问题，还能够提升香蕉的营养价值和市场竞争力。