茉莉酸激活的AaWRKY9–AabHLH93/AabHLH93–AaMYB7复合体在青蒿（Artemisia annua）中调节青蒿素的生物合成

《Plant Biotechnology Journal》：Jasmonate-Activated AaWRKY9–AabHLH93/AabHLH93–AaMYB7 Complexes Balance Artemisinin Biosynthesis in Artemisia annua

通过酵母双杂交筛选鉴定了AabHLH93作为调控青蒿素合成的关键转录因子，其与AaWRKY9形成协同激活复合体促进目标基因表达，而AaMYB7通过结合AabHLH93的C端域拮抗该复合体活性，调控青蒿素合成随叶龄变化的动态平衡。研究发现JA和光信号通过影响AaMYB7和AaJAZ9的表达水平调控该过程。

　　在自然界中，疟疾仍然是一个影响全球公共卫生的重大问题，每年有数百万人感染，这促使科学家不断探索更有效的治疗手段。青蒿素，一种从黄花蒿（*Artemisia annua*）中提取的倍半萜内酯类化合物，因其在抗疟疾治疗中的关键作用而备受关注。近年来，研究者们发现青蒿素的合成不仅依赖于特定的代谢途径，还受到复杂的基因调控网络的影响。然而，尽管已有大量研究揭示了青蒿素生物合成的分子机制，其基因表达的动态调控，特别是年轻叶片中高表达和成熟叶片中表达水平显著下降的现象，仍然是一个未解之谜。本文通过深入研究，揭示了调控青蒿素合成的关键分子机制，为未来提高青蒿素产量提供了理论基础和实践指导。

青蒿素主要在黄花蒿的腺毛中合成和积累。腺毛是一种特殊的植物结构，具有分泌功能，其内部的细胞组织包括两个柄细胞、两个基部细胞和三对分泌细胞。青蒿素的生物合成涉及多个酶，如爱茉莉-4,11-二烯合成酶（ADS）、细胞色素P450单加氧酶（CYP71AV1）、细胞色素P450还原酶（CPR）、青蒿素醛D-11(13)-双键还原酶（DBR2）、醛脱氢酶（ALDH1）、醇脱氢酶（ADH1）以及细胞色素b5单加氧酶（CYB5）。此外，DHAA转化为青蒿素和AA转化为arteannuin B的过程还涉及非酶促的光氧化反应。然而，尽管这些酶的表达已被广泛研究，调控这些基因表达的转录因子及其作用机制仍需进一步探索。

研究者们发现，多种转录因子参与了青蒿素生物合成的调控。例如，AaWRKY1能够通过激活AaADS、AaCYP71AV1和AaDBR2的表达，提升青蒿素含量。此外，AaERF1、AaERF2、AaORA和AaTAR1等APETALA 2/ETHYLENE RESPONSIVE FACTOR（ERF）蛋白也被证实是青蒿素合成的正向调控因子。这些转录因子通过结合特定的启动子区域，如W-box或G-box，促进相关基因的表达。植物激素，特别是茉莉酸（JA），在调控青蒿素合成中发挥重要作用。AaGSW1，一种特定于腺毛的WRKY转录因子，通过结合AaCYP71AV1和AaORA的启动子中的W-box元件，增强其表达，从而促进青蒿素合成。同样，AaMYC2作为一种响应JA的bHLH转录因子，能够通过结合AaDBR2启动子中的G-box元件，激活其表达，进而提升青蒿素产量。

尽管这些转录因子在青蒿素合成中具有重要作用，但它们的表达模式却与植物的发育阶段密切相关。在年轻叶片中，青蒿素相关酶基因和转录因子基因的表达水平显著升高，而在成熟叶片中则迅速下降。这种表达模式的转变，不仅影响青蒿素的合成，也对整个植物的代谢调控网络产生深远影响。研究者们通过转录组分析发现，AaWRKY9，一种特异性表达于腺毛的WRKY转录因子，能够通过结合AaDBR2和AaGSW1的启动子中的W-box元件，促进青蒿素的积累。此外，AaHY5，一种bZIP转录因子，能够诱导AaWRKY9的表达，从而进一步增强青蒿素的合成。同时，AaJAZ9，一种JA信号通路的抑制因子，能够抑制AaWRKY9的转录活性，这表明JA信号可能通过调控AaJAZ9的稳定性来间接影响青蒿素的合成。

为了进一步揭示调控青蒿素合成的分子机制，研究者们采用酵母双杂交技术，以AaWRKY9为诱饵，筛选出与其相互作用的蛋白。通过这一筛选，他们发现AabHLH93是一种特异性富集于腺毛的bHLH转录因子。进一步的实验验证了AabHLH93与AaWRKY9之间的直接相互作用，包括荧光互补实验、双分子荧光互补（BiFC）和共免疫沉淀（Co-IP）等方法。这些实验结果表明，AabHLH93和AaWRKY9能够形成一个协同激活复合物，从而增强青蒿素生物合成基因的表达。此外，研究还发现，AabHLH93能够直接结合到AaCYP71AV1的启动子区域，通过激活该基因的表达来促进青蒿素的合成。

然而，随着叶片的成熟，AaMYB7的表达水平逐渐上升，这表明其可能在调控青蒿素合成中扮演抑制性角色。AaMYB7是一种R2R3-MYB转录因子，具有一个保守的EAR（ERF相关抑制）结构域。该结构域能够招募核心抑制因子，如TOPLESS（TPL），从而抑制目标基因的转录。通过转基因实验，研究者们发现AaMYB7的过表达会导致青蒿素含量显著下降，而其RNAi抑制则会促进青蒿素的积累。这些结果表明，AaMYB7可能通过抑制关键的生物合成基因表达，从而降低青蒿素的产量。

此外，研究还揭示了AabHLH93与AaMYB7之间的相互作用。AaMYB7能够通过其C端结构域与AabHLH93结合，从而干扰AabHLH93与AaWRKY9形成的激活复合物。这种竞争性抑制作用可能通过阻断AabHLH93的转录激活能力，从而削弱青蒿素的合成。在成熟叶片中，随着JA水平的下降，AaMYB7的表达被上调，同时AaJAZ9的积累也增加。AaJAZ9能够抑制AaWRKY9的转录活性，这进一步表明JA信号可能通过调控AaJAZ9的稳定性来影响AaWRKY9的表达，从而调节青蒿素的合成。

研究者们还发现，AabHLH93的表达受到光照和JA信号的双重调控。在黑暗条件下，AabHLH93的表达水平显著降低，而在红光或蓝光刺激下，其表达迅速上升。同时，MeJA处理能够显著上调AabHLH93的表达，这表明JA信号在调控AabHLH93的表达中起着关键作用。这种双重调控机制可能为青蒿素合成提供了更精细的调控方式，使植物能够在不同的环境条件下调整其代谢活动，以优化青蒿素的积累。

综合来看，青蒿素的生物合成是一个高度调控的过程，涉及多种转录因子和植物激素的协同作用。AabHLH93和AaWRKY9形成的协同激活复合物在年轻叶片中促进青蒿素的合成，而AaMYB7和AaJAZ9则在成熟叶片中发挥抑制作用。这种动态的调控机制可能使植物能够在不同的发育阶段和环境条件下，精确控制青蒿素的合成和积累。这些发现不仅加深了我们对青蒿素生物合成调控机制的理解，也为通过基因工程手段提高青蒿素产量提供了新的思路和方法。