通过量热法研究了来自Methylocella silvestris BL2菌株的三甲胺-N-氧化物（TMAO）脱甲基酶的稳定性和活性

《Protein Science》：Calorimetric characterization of the stability and activity of trimethylamine-N-oxide (TMAO) demethylase from Methylocella silvestrisBL2

本研究解析了产自Methylocella silvestris BL2的TMAO demethylase（Tdm）的结构与功能。通过AlphaFold预测其三维结构，揭示Tdm由N端DUF1989-like域、中间未报道的DUF1989-like域及C端Gcv_T-like域组成，并验证了Zn2?和Fe2?的协同结合位点。DSC显示Tdm在50°C和65°C发生两次不可逆解折叠，表明其通过寡聚化稳定。ITC实验表明，Tdm的最佳反应pH为7.0，检测限达10μM，且在100nM浓度下kcat值达15.47 s?1。该研究为开发直接、灵敏的TMAO生物传感器提供了理论依据。

　　TMAO，即三甲胺-N-氧化物，是一种在多种生物体中广泛存在的有机渗透调节物质。其在生物体中的作用不仅限于维持细胞内外的渗透压平衡，还涉及多种生理和病理过程。近年来，TMAO在医学领域引起了广泛关注，尤其是在心血管疾病（CVD）的关联性研究中。研究表明，TMAO在人体内的高浓度与心血管疾病的发生风险密切相关，这使得对TMAO的可靠检测和定量成为医学研究的重要课题。然而，目前常用的检测方法如色谱技术，不仅成本高昂，还需要专业人员操作，且存在一定的安全隐患。因此，开发一种快速、简便、安全的TMAO检测方法具有重要的临床和科研价值。

本研究聚焦于一种土壤细菌——Methylocella silvestris BL2，该菌株的基因组中包含一种能够催化TMAO脱甲基化的酶，称为TMAO脱甲基酶（Tdm）。这种酶能够将TMAO转化为二甲胺和甲醛，并且在有氧或无氧条件下均能进行反应。由于其无需外部氧气来源，这使得Tdm在生物催化领域展现出独特的潜力。然而，由于Tdm的晶体结构尚未被确定，其具体的分子构象和催化机制仍然存在诸多未知。为此，研究团队利用AlphaFold软件预测了Tdm的三维结构，并通过生物信息学分析、表达纯化和热力学表征等手段，进一步揭示了该酶的结构特征和功能特性。

通过AlphaFold的结构预测，研究发现Tdm可能由三个结构域组成，其中N端的DUF1989样结构域与C端的Gcv_T样结构域具有高度相似性，而中间的第三个结构域则尚未被报道。值得注意的是，尽管该酶的结构预测显示其为六聚体，但通过分析性尺寸排阻色谱（SEC）实验，研究发现其分子量可能在682 kDa（八聚体）到427 kDa（五聚体）之间波动，这表明Tdm可能具有复杂的寡聚状态。此外，AlphaFold模型显示，该酶的结构域之间存在紧密的相互作用，尤其是DUF1989结构域在寡聚化过程中起着重要作用。这些结构特征不仅有助于理解Tdm的分子机制，也为后续的生物工程应用提供了理论依据。

为了进一步探索Tdm的功能特性，研究团队进行了表达和纯化实验。Tdm基因被克隆到pET28a(+)质粒中，并在E. coli BL21菌株中表达。通过镍离子亲和层析（IMAC）技术，研究成功纯化了Tdm，并通过SDS-PAGE电泳确认了其纯度。实验结果表明，纯化后的Tdm具有显著的催化活性，能够在60分钟内将TMAO完全转化为甲醛和二甲胺。相比之下，Tdm的N端结构域和Gcv_T样结构域则表现出较低的活性，甚至接近于无酶对照组的水平。这表明Tdm的催化活性依赖于其完整的四聚体或六聚体结构，而非单一结构域。此外，SEC实验还显示，Tdm的N端结构域在溶液中无法形成稳定的寡聚结构，进一步支持了其活性与结构完整性之间的紧密联系。

为了深入了解Tdm的热力学行为，研究团队采用了差示扫描量热法（DSC）对其热稳定性进行了分析。DSC实验结果显示，Tdm在加热过程中表现出两个独立的吸热峰，分别对应于其结构域的展开过程。这表明Tdm的结构可能由两个主要的热力学单元组成，其中一个单元可能在较低温度下展开，而另一个则在较高温度下发生结构变化。值得注意的是，DSC数据表明Tdm的展开过程是不可逆的，这意味着一旦其结构被破坏，便无法恢复原有活性。这一发现对理解Tdm的稳定性具有重要意义，也为后续的酶工程和生物传感器开发提供了基础。

为了更精确地测定Tdm的反应条件，研究团队进一步利用等温滴定量热法（ITC）对酶的pH依赖性和TMAO检测限进行了分析。实验结果显示，Tdm在pH 7.0时表现出最高的反应活性，这一pH值被认为是其最佳反应条件。此外，通过调整酶和底物的浓度，研究确定了Tdm的最低有效浓度为100 nM，而TMAO的检测限为10 μM。这些数据不仅为Tdm的定量分析提供了依据，也表明该酶在临床检测中具有较高的灵敏度和实用性。特别是，TMAO的检测限（10 μM）与病理浓度范围（通常≥10 μM）相匹配，说明该方法在临床应用中具有较高的可行性。

在酶动力学研究方面，研究团队通过多注射模式的ITC实验，测定了Tdm的米氏常数（K_m）和最大反应速率（V_max）。结果表明，Tdm在100 nM浓度下具有最高的_kcat值，为15.47 s^?1。这一数据表明Tdm具有较高的催化效率，能够快速地将TMAO转化为产物。此外，研究还发现，即使在完全变性的情况下，Tdm仍能保留约21%的催化活性。这表明，其催化活性可能与结构域的局部折叠或某些保守结构元素有关，而并非依赖于整个分子的完整结构。这种残余活性的存在为Tdm在极端条件下的应用提供了新的思路，尤其是在开发耐热或耐氧的生物催化剂方面。

研究团队还通过ITC实验探索了Tdm在不同pH值和不同浓度下的反应行为，以优化其检测方法。实验结果显示，Tdm在pH 7.0时表现出最优的催化活性，这一pH值与人体血液中的中性环境相吻合，因此该方法在临床应用中具有较大的优势。同时，通过改变底物和酶的浓度，研究确定了Tdm的最低检测限为10 μM，这一浓度范围与临床TMAO水平相符，表明该方法能够有效识别病理状态下的TMAO浓度。此外，通过多注射模式的ITC实验，研究还获得了精确的酶动力学参数，为Tdm在生物医学领域的应用提供了可靠的理论支持。

综上所述，本研究通过结合AlphaFold结构预测、DSC热稳定性分析和ITC动力学测定，全面揭示了Tdm的结构特征、热力学行为和催化活性。研究发现，Tdm具有复杂的寡聚结构，并且其催化活性高度依赖于完整的结构域之间的相互作用。此外，该酶在中性pH条件下表现出最佳反应性能，并且能够以较低浓度检测到TMAO。这些发现不仅有助于深入理解TMAO代谢机制，也为开发新的TMAO检测方法提供了科学依据。未来，Tdm有望被应用于临床诊断和生物传感技术，特别是在心血管疾病的早期筛查和治疗监测方面。此外，其在生物工程中的潜在应用，如构建耐热或耐氧的酶系统，也值得进一步探索。通过进一步优化其表达条件和结构稳定性，Tdm有望成为一种高效、安全且经济的TMAO检测工具，为相关研究和实际应用提供重要支持。