在增殖性糖尿病视网膜病变的发病机制中，关键线粒体吞噬相关生物标志物的识别与验证

《Frontiers in Endocrinology》：Identification and validation of key mitophagy-related biomarkers in the pathogenesis of proliferative diabetic retinopathy

增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）的线粒体自噬相关基因（DEMRGs）通过整合GEO数据集的生物信息学分析和体外高糖模型验证，揭示了CASP8和COL1A1作为核心驱动基因，其表达变化与免疫细胞浸润模式（如CD8+ T细胞、巨噬细胞增多）及线粒体-溶酶体共定位增强相关，为PDR的分子分型和靶向治疗提供新思路。

　　糖尿病视网膜病变（Diabetic Retinopathy, DR）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，而增殖性糖尿病视网膜病变（Proliferative Diabetic Retinopathy, PDR）则是其最为严重的阶段。PDR的发病机制复杂，涉及多种细胞和分子层面的改变。近年来，线粒体自噬（Mitophagy）作为一种选择性清除受损线粒体的细胞自噬形式，被发现与DR的发展密切相关。线粒体自噬不仅在维持细胞稳态中发挥重要作用，还在应对各种应激反应中扮演关键角色。然而，线粒体自噬在PDR中的具体机制仍未完全阐明，因此，探索其在PDR中的作用成为当前研究的重点。

为了更深入地理解线粒体自噬在PDR中的作用，研究人员通过整合生物信息学分析与实验验证的方法，系统地分析了线粒体自噬相关基因（Mitophagy-Related Genes, MRGs）在PDR中的表达变化。研究团队利用公开的GEO数据库中的GSE102485和GSE60436数据集，对PDR患者的视网膜组织和正常对照组样本进行了差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）的筛选和分析。通过对这些差异表达基因进行功能注释、通路富集分析以及蛋白互作网络分析，研究人员确定了8个与PDR显著相关的差异表达线粒体自噬相关基因（Differentially Expressed Mitophagy-Related Genes, DEMRGs），其中CASP8和COL1A1被进一步识别为关键的“枢纽基因”（hub genes）。这些基因在PDR中的表达模式不仅通过生物信息学方法得到了预测，还通过体外实验在人视网膜色素上皮细胞系（ARPE-19）中得到了初步验证。

在体外实验中，研究人员模拟高血糖环境，将ARPE-19细胞暴露于高浓度葡萄糖（30 mM），以构建糖尿病视网膜病变模型。通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）、蛋白质印迹（Western Blot）和免疫荧光显微镜（Immunofluorescence Microscopy, IF）等多种技术手段，研究团队发现高血糖刺激显著增强了线粒体与溶酶体的共定位，同时提高了与线粒体自噬相关的蛋白表达水平。这表明线粒体自噬在高血糖条件下可能被激活，以应对线粒体功能的损害。此外，线粒体膜电位（Mitochondrial Membrane Potential, MMP）的变化也通过JC-1染色得到了验证，结果显示高血糖导致线粒体膜电位下降，提示线粒体功能受损，这与线粒体自噬的增强相吻合。

线粒体自噬的异常与多种疾病的发生发展密切相关，包括DR和年龄相关性黄斑变性（Age-related Macular Degeneration, AMD）。在AMD中，过量的活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）通过p62/Keap1/Nrf2轴激活线粒体自噬，这一机制在视网膜色素上皮细胞（RPE）中尤为显著。而在DR中，RPE细胞的功能障碍可能在低血糖条件下促进线粒体自噬，但在高血糖环境下则抑制线粒体自噬，从而导致线粒体功能障碍和视觉功能下降。这一发现提示线粒体自噬在DR的病程中可能具有双重作用，既可能作为细胞的自我修复机制，也可能在某些情况下成为细胞损伤的推手。

为了进一步探讨线粒体自噬与PDR之间的关系，研究团队对PDR的免疫浸润模式进行了分析。他们利用xCell算法对训练集中的免疫细胞类型进行了富集分析，发现PDR患者的免疫细胞组成与健康个体存在显著差异。例如，CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、树突状细胞（Dendritic Cells, DCs）和巨噬细胞的浸润水平在PDR患者中明显升高，而B细胞、自然杀伤细胞（Natural Killer Cells, NK cells）和调节性T细胞（Regulatory T cells, Tregs）的水平则有所下降。这一结果表明，PDR可能伴随着特定的免疫细胞重塑，其中某些细胞类型可能参与了疾病的发展过程。

此外，研究团队还通过加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）和蛋白质互作网络分析（Protein-Protein Interaction, PPI）进一步识别了PDR相关的基因模块和关键节点。这些分析不仅揭示了基因表达模式与疾病表型之间的潜在联系，还帮助研究人员筛选出与线粒体自噬密切相关的枢纽基因。通过交叉分析这些基因在不同免疫细胞类型中的表达情况，研究团队发现CASP8和COL1A1与多种免疫细胞类型存在显著相关性，其中COL1A1与巨噬细胞的正相关性最强，而CASP8与树突状细胞的正相关性也较为显著。这提示CASP8和COL1A1可能在PDR的免疫调控过程中发挥重要作用。

为了验证这些基因在PDR中的潜在作用，研究团队进一步构建了PDR的分子亚型，并分析了不同亚型之间的基因表达和免疫细胞浸润模式。结果显示，PDR样本被分为两个亚型：经典激活型M1巨噬细胞（MC1）和替代激活型M2巨噬细胞（MC2）。在MC1亚型中，COL1A1的表达水平显著下降，而在MC2亚型中则有所上升。这种表达模式的差异可能反映了不同亚型在PDR发病机制中的不同作用。同时，CASP8和COL1A1在不同亚型中的表达模式也表现出一定的特异性，提示它们可能在PDR的不同阶段或不同组织区域中发挥不同的调控功能。

值得注意的是，尽管研究结果为PDR的发病机制提供了新的见解，但这些结论仍基于公共数据库的分析和算法推断，缺乏直接的临床验证。因此，研究团队强调，未来的研究应结合动物模型和患者来源的组织样本，进一步验证这些基因在PDR中的作用。此外，由于当前的分析主要基于整体组织的转录组数据，可能无法完全反映不同细胞类型或组织区域中的基因表达特异性。因此，未来的研究可以考虑采用单细胞RNA测序（Single-cell RNA Sequencing, scRNA-seq）和空间转录组学（Spatial Transcriptomics）等新技术，以更精确地解析线粒体自噬在PDR中的分子机制。

总的来说，这项研究通过整合生物信息学分析和体外实验，揭示了线粒体自噬在PDR中的潜在作用，并确定了多个可能与PDR发展相关的基因。特别是CASP8和COL1A1作为枢纽基因，可能在调节线粒体自噬和免疫反应中发挥关键作用。然而，这些发现仍处于初步阶段，需要更多的实验和临床数据来进一步验证其在PDR中的具体机制和应用价值。未来的研究应聚焦于这些基因的功能研究，以及它们在PDR中的调控网络，以期为糖尿病视网膜病变的早期诊断和治疗提供新的靶点和思路。