综述：囊泡中细胞的牺牲：生殖系囊泡通过酸化的非凋亡细胞死亡

《Frontiers in Cell Death》：Sacrificing cells of the cyst: non-apoptotic cell death in germline cysts via acidification

本综述系统阐述了生殖系囊泡细胞通过酸化的非凋亡性死亡机制，揭示了果蝇与小鼠模型中由周围体细胞（如伸展滤泡细胞SFCs）主导的吞噬性死亡（Phagoptosis）新范式，涉及Draper（Drpr）、Ced-12、JNK等吞噬通路及V-ATPase介导的胞外酸化的协同作用，为理解发育编程性细胞清除及生殖健康提供了新视角。

　　

细胞死亡途径的多样性

多细胞生命的维持依赖于细胞死亡。从发育过程中清除多余细胞，到促进细胞更新以预防疾病，细胞死亡在塑造多细胞生物个体细胞命运中扮演着哨兵和雕塑家的角色。虽然凋亡和坏死已在许多模型系统和情境中得到广泛研究，但非凋亡性细胞死亡范例的发现极大地扩展了这一领域。这些死亡途径被统称为调节性细胞死亡（RCD），它们以组织和情境依赖的方式运作。

细胞清除

几乎所有形式的RCD都会产生细胞残骸，如果未被清除则可能引发炎症。垂死细胞表面的分子，如磷脂酰丝氨酸（PtdSer）和钙网蛋白，以及这些细胞释放的分子，如核苷酸和S1P，分别被称为“吃我”和“找我”信号，它们能吸引吞噬细胞。根据功能特异性和在体内的分布，吞噬细胞可分为三类：专业吞噬细胞、非专业吞噬细胞以及在专业吞噬细胞无法进入的组织中高度特化的常驻细胞。吞噬细胞吞噬和处理残骸的一般机制在不同类别的吞噬细胞中被认为是相似的。

吞噬性死亡

传统观点认为“自身”细胞只有在死亡或垂死时才会被清除，但研究表明，有活力的细胞也可能被吞噬，否则它们会继续存活。这种形式的细胞死亡，即利用一个细胞的吞噬装置杀死另一个细胞，被命名为吞噬性死亡。在吞噬性死亡中，吞噬细胞杀死靶细胞，而在吞噬作用中，吞噬细胞清除已死或垂死的细胞。

生殖细胞囊泡

在众多生物体的卵巢和精巢中，减数分裂前的生殖细胞在相互连接的细胞囊泡中发育，并可能响应环境或发育信号而死亡。最近的研究结果表明，生殖细胞囊泡可能使用一种涉及周围体细胞的吞噬和溶酶体活性的非凋亡性细胞死亡的共同机制。对果蝇成虫卵巢和精巢中囊泡细胞死亡的分析最为透彻，与小鼠成虫精巢和胎儿卵巢中的囊泡细胞死亡具有显著的相似性。

果蝇卵子发生中的凋亡和非凋亡死亡

果蝇的卵子发生受到高度调控，需要生殖系和体细胞在时空上的精确协调。在最佳条件下，每个有活力的卵母细胞在卵巢内经历14个发育阶段。生殖系来源的卵母细胞和滋养细胞（NCs）被单层体细胞滤泡细胞（FCs）包围，形成卵室。

生殖系细胞死亡可在发育的生殖期后两个不同阶段被触发。第一种细胞死亡形式发生在卵子发生中期。在不利或应激条件下，细胞死亡可通过大约在卵子发生一半时（第7-9阶段）的一个关键检查点被诱导，导致整个卵室退化。在此过程中，FCs吞噬卵母细胞和NCs，后者经历凋亡和自噬性死亡。吞噬受体Draper（Drpr）在中期死亡期间表达于FCs膜上，识别凋亡的生殖细胞并激活JNK信号以促进细胞清除。

卵巢中生殖细胞死亡的第二种形式发生在卵子发生后期（第10-14阶段），此时滋养细胞被特异性清除。这种发育性的NC死亡是非凋亡性和非自噬性的；即使在生殖系中破坏胱天蛋白酶和自噬相关基因，NC死亡仍然发生。在卵子发生的后期阶段，卵室形态发生变化，少数位于前部的FCs伸长和变平，被定义为伸展FCs（SFCs），这些细胞迁移并延伸到NCs之间的空间。这些SFCs是卵子发生末期NCs死亡和清除的关键参与者。

SFCs的遗传消融揭示，它们对NCs的胞质倾倒和DNA断裂是必需的，表明对NC死亡的非细胞自主控制。此外，吞噬作用机制的组成部分drpr、Ced-12和JNK信号通路在SFCs内是发育性NC死亡所必需的。对吞噬作用基因的需求将NC死亡归类为吞噬性死亡。

伸展滤泡细胞向吞噬细胞的转化

果蝇卵巢被认为是免疫豁免的，意味着血细胞（巨噬细胞）不会进入卵巢充当专业吞噬细胞来清除垂死的NCs。在卵子发生后期，NC残留物被SFCs有效清除，SFCs承担非专业吞噬细胞的作用，直接介导NCs的清除。

最近发现蜕皮激素在调节发育性NC死亡期间的吞噬作用中发挥作用。在阶段11，蜕皮激素与其受体（EcR）结合诱导转录因子（TF）Eip93F定位到细胞核，促进croquemort（crq）和drpr的转录。Drpr在SFCs膜上的富集在阶段11首次可见，表明蜕皮激素触发该吞噬受体表达的起始。在阶段12-13，Drpr表达通过JNK信号的正向循环以及通过Ced-12激活的JNK而增加和持续。此外，蜕皮激素介导SFCs的上皮-间质转化（EMT），以转录因子Serpent（Srp）为标志。Srp在SFCs中的表达可能是其向吞噬命运转变的一个指标。

Crq在卵子发生中的作用尚未被彻底研究。尽管最初将Crq描述为吞噬受体，但最近的研究表明Crq对于凋亡过程中的吞噬不是必需的。Crq通过溶酶体参与吞噬体成熟和降解。Crq是NCs正确清除所必需的。

另一个可能参与SFC介导的死亡过程中脂质运输的蛋白质是Eato，它影响Drpr在SFC膜上的积累以及围绕NCs的膜伸展。Eato是秀丽隐杆线虫中ABC转运蛋白Ced-7的直系同源物，后者在垂死细胞的吞噬过程中有助于脂质运输。

虽然Drpr作为吞噬受体在凋亡和非凋亡死亡中已得到广泛表征，但推测存在一个额外的受体参与吞噬性死亡。跨膜受体整合素αPS3和βPS在阶段11-13的SFCs膜上富集，并可能作用于Ced-12的上游。drpr和αPS3的双突变体显示存留NC核（PNCN）的数量高于任一单突变体，表明它们在不平行的通路中发挥作用。

与许多其他形式的RCD中形成单个吞噬杯来内吞垂死细胞不同，发育性NC死亡涉及围绕每个NC的四到五个SFCs的协作。这些SFCs的完全覆盖是NC清除所必需的。

在NC清除的最后阶段，液泡ATP酶（V-ATPases）在SFCs的质膜上富集，促进NC残留物的酸化。氯离子通道类似地定位，可能平衡由V-ATPase活性形成的离子梯度。V-ATPase蛋白复合物通常参与溶酶体的酸化并存在于溶酶体膜中，尽管某些特化的细胞类型确实将V-ATPase靶向质膜。在阶段12，SFCs中与NCs相邻的溶酶体发育，但在其他FC亚型中未观察到。然而，V-ATPase似乎不是通过溶酶体定位到质膜；V-ATPase在SFCs中如何运输尚不清楚。V-ATPase基因的表达受TF Mitf控制，敲低Mitf会导致PNCN。Drpr是NCs酸化所必需的，表明它可能影响V-ATPase或Mitf的表达。酸化后，组织蛋白酶如CP1由SFCs释放到细胞外环境中，并在低pH下被激活。在DNaseII的辅助下，NC的核纤层和染色质被降解。因此，NCs的最终消亡是由胞外酸化和释放的酶介导的，而不是典型的吞噬溶酶体酸化。

果蝇精子发生中的凋亡和非凋亡死亡

果蝇精巢的顶端尖端容纳两个成体共分化干细胞谱系——生殖干细胞（GSCs）产生精原生殖细胞，以及体细胞囊泡干细胞（CySCs），产生上皮组织，包裹经历 transit-amplifying 分裂的精原细胞形成囊泡。GSCs和CySCs散布并直接接触一群有丝分裂后的hub细胞。hub细胞是构成干细胞生态位的核心组成部分。

在精巢中，“囊泡”一词有两种不同的含义。首先，它指代CySCs分裂后产生的体细胞囊泡细胞。其次，囊泡用于描述分化单位，包括包裹和护送一群克隆相关的精原细胞的囊泡细胞。精原祖细胞来自GSCs的四次连续分裂，最初产生精原细胞，即GSCs不对称分裂后从生态位移位的单一生殖子细胞。每个精原细胞进行有丝分裂 transit-amplifying 分裂并伴随不完全的胞质分裂，在单个囊泡内形成2、4、8和16个生殖细胞的精原细胞簇。

正如蛋白质剥夺会触发果蝇卵子发生中期的生殖系凋亡一样，正在进行 transit-amplification 的精巢生殖系囊泡也已被证明会经历饥饿诱导的细胞死亡，同时保持GSCs的能力。在饥饿状态下，凋亡在囊泡细胞中被诱导，进而触发被包裹的精原细胞死亡。垂死的囊泡细胞对裂解的胱天蛋白酶-3呈阳性，证实了凋亡途径的激活。相比之下，因此死亡的精原细胞对LysoTracker和TUNEL呈阳性，但对裂解的胱天蛋白酶-3仍呈阴性，表明它们的死亡不是通过经典凋亡发生的。这些发现指向一种由周围囊泡细胞凋亡引发的非凋亡性生殖细胞死亡机制。

在无应激的果蝇精子发生过程中，生殖系细胞死亡与卵子发生过程中的NC吞噬性死亡有着惊人的相似性。对固定精巢样本的成像表明，20%-30%的有丝分裂精原细胞囊泡在稳态条件下经历自发的生殖细胞死亡。功能丧失突变体未能降低细胞死亡水平，从而排除了效应胱天蛋白酶激活的作用，并确定精子发生中的发育性生殖细胞死亡是非凋亡性的。然而，生殖细胞死亡需要Caspase-9/Dronc的非典型功能，该功能独立于其催化活性及其与凋亡体的相互作用。自噬性死亡也被排除，因为Atg7和Atg8的功能丧失突变体，以及在精原细胞中过表达Atg1并未引发强烈的细胞死亡反应。生殖细胞死亡涉及酸化的第一个迹象是由于观察到精子发生中期和晚期的垂死囊泡与LysoTracker和TUNEL强烈共染色。随后对溶酶体相关基因CathD（组织蛋白酶D）、dor（深橙色）、car（石竹）和DNaseII的突变体筛选显示垂死囊泡的数量显著减少，明确涉及溶酶体在精原细胞囊泡死亡中的作用。

随后的遗传筛选和活体成像证实，酸化对于生殖细胞死亡至关重要，并且其控制非自主地在于周围囊泡细胞的溶酶体分泌。囊泡细胞参与生殖系酸化的证据来自对Lamp1（一种溶酶体膜蛋白和吞噬机制的重要组成部分）的活体成像。表达Lamp1-GFP的囊泡细胞来源的吞噬体在LysoTracker染色之前被观察到聚集在囊泡细胞和精原生殖细胞之间的间隙区域，并且用RNAi破坏囊泡细胞中的Lamp1减少了生殖系的死亡——这是吞噬性死亡的必要条件。类似地，囊泡细胞中Rab5-YFP和Rab7-YFP阳性的内体被观察到定位于生殖细胞周围，先于LysoTracker和TUNEL信号。这些吞噬体包围整个精原细胞，表明相互连接的生殖细胞作为一个整体被吞噬。值得注意的是，在囊泡细胞中RNAi介导的Rab5敲低完全阻止了生殖细胞死亡，进一步支持了囊泡细胞介导的吞噬性死亡在这一过程中的作用。

除了酸化，精原细胞死亡在形态上以及用于生殖系吞噬和清除的机制上都与NC吞噬性死亡高度相似。与SFCs将其突起延伸到NCs周围非常相似，观察到囊泡细胞膜伸展到酸化后降解的生殖细胞染色质存在的区域。吞噬受体Drpr和Crq也被发现在囊泡细胞中高表达，但推测它们扮演互补的角色。drpr和Ced-12被确定对吞噬是必需的且不影响酸化，而crq RNAi仅影响酸化而不破坏吞噬。drpr或Ced-12功能丧失导致吞噬缺陷，并在精巢顶端尖端导致增生，未吞噬的活精原细胞积累，引起明显的组织增大。p53无效突变体中也观察到类似表型，表明肿瘤抑制因子p53在促进生殖细胞死亡中的作用。与精巢相反，在卵巢中drpr或Ced-12的缺失会破坏NC吞噬性死亡中的酸化和吞噬。与NC吞噬性死亡的进一步相似之处是囊泡细胞激活JNK，并且需要整合素用于生殖细胞死亡，这两点都让人想起卵巢中的SFCs。

与在精巢吞噬细胞中鉴定出的多种吞噬受体相比，尚未在生殖细胞中检测到主动促进其吞噬性死亡的信号。在已经死亡或垂死的细胞中，靶标识别通常通过暴露的“吃我”信号发生，其中PtdSer是特征最明确的。在果蝇精巢中，PtdSer仅在生殖细胞被囊泡细胞吞噬后才被检测到。这表明其他“吃我”信号可能表达在活生殖细胞上，独立于PtdSer暴露介导其识别和吞噬性死亡，但这些信号仍有待鉴定。

小鼠卵子发生中的生殖系死亡是非凋亡性的

一个令人兴奋的最新发现表明，小鼠卵子发生中的生殖系死亡和清除是酸化吞噬性死亡主题的一个变奏。与果蝇卵室类似，小鼠生殖细胞在称为囊泡的聚集体中发育。原始生殖细胞经过有丝分裂形成多达32个同步发育、相互连接的滋养细胞簇。小鼠NCs执行与果蝇NCs类似的功能。母系线粒体从NCs转移到卵母细胞的一个称为巴尔比尼体的聚集体中，之后NCs以一种非常熟悉的方式被清除。

先前被认为是凋亡，研究表明，小鼠卵巢中的生殖系死亡由周围上皮前颗粒细胞的吞噬机制控制。在卵子发生后期观察到NCs中的LysoTracker活性增加。此外，在含有生殖系囊泡的培养物中使用Bafilomycin A1抑制V-ATPase活性，导致LysoTracker活性缺失和NC核存留。单细胞RNA-seq数据分析显示，卵子发生后期的前颗粒细胞表达几种V-ATPase亚基和组织蛋白酶Ctsb、Ctsd、Ctsl（果蝇Cp1的直系同源物）和Ctsz。然而，这种表达在卵子发生中是否是时间可变的——从卵子发生早期前颗粒细胞中的低表达开始，在NC胞质内容物转移到卵母细胞后增加——尚不清楚。

还做了一个重要观察，即生殖细胞凋亡与吞噬性死亡同时发生，尽管水平显著较低，并理论化凋亡性死亡用于清除不可行的生殖细胞。这一观察结果也与对果蝇配子发生中饥饿诱导的生殖系死亡的研究一致。这表明凋亡和非凋亡途径存在优先激活，其中特定的线索和条件导致确定性的结果。总之，这些在果蝇和小鼠模型中的激动人心的发现表明，通过体细胞支持细胞进行的吞噬性死亡是配子发生中生殖系清除的一种保守机制。

最后的倒计时：酸化作为细胞杀伤机制可能为配子发生所特有

这些发现也提出了关于吞噬性死亡性质的重要问题，例如确定介导这种细胞暗杀所必需和充分的条件、它进化的条件以及当它出错时的后果。吞噬性死亡最初在涉及小胶质细胞吞噬的神经元死亡中被表征。受压但仍有能力的神经元在其膜上暴露PtdSer，被小胶质细胞吞噬。然而，阻断小胶质细胞吞噬或逆转神经元上的PtdSer暴露阻止了它们的吞噬，表明神经元的存活是由小胶质细胞的吞噬机制外在地控制的。

虽然果蝇精巢中的细胞死亡似乎通过“典型的”吞噬性死亡机制进行，即单个细胞吞噬先于吞噬溶酶体酸化，但卵巢中的NC死亡通过另一种吞噬性死亡机制发生，涉及多个细胞的吞噬机制促进大得多的靶细胞的胞外酸化。有趣的是，胞外酸化在其他情境中似乎不扮演死亡相关的作用。这表明通过酸化的吞噬性死亡是细胞清除的一个特例，专门在配子发生中进化。质膜表达V-ATPases的胞外质子分泌先前已被证明在细胞死亡之外的情境中发生。在啮齿动物肾脏中，上皮闰细胞已被证明在其质膜上表达V-ATPases以调节集合管中的pH稳态。V-ATPases的质子分泌和组织蛋白酶功能已知对骨吸收和骨基质水解至关重要。V-ATPases异常多样的功能及其同样令人印象深刻的结构构象和定位模式已在别处得到全面综述，但它们参与细胞杀伤迄今为止似乎仅限于配子发生。

从进化角度看，这初看是令人困惑的悖论。为什么囊泡会进化出一种明显具有破坏性的方法来清除生殖系，考虑到它离发育中的配子如此之近？鉴于生殖适应性是进化的基础，一个危险孵化的配子似乎有违直觉。一种可能性是，虽然酸化可能对NCs有害，但它可能不会损害配子，甚至可能有益于其发育和能力。啮齿动物的雄性生殖道维持酸性环境以帮助新生精子获得受精能力和成熟，这毫不奇怪是通过V-ATPases执行胞外质子分泌来实现的。需要对配子发生中的pH调节进行系统研究，同时关注配子能力，以证实这一假设。

开放性问题和未来方向

在这些生殖系囊泡细胞死亡的例子中，体细胞控制生殖细胞的死亡和清除，这种形式的细胞死亡被称为吞噬性死亡。然而，并非所有吞噬性死亡都使用相同的分子机制，还有许多有待发现。果蝇NC死亡由周围上皮SFCs非自主控制。这些上皮细胞含有溶酶体机制，已被证明是NC死亡最后步骤所必需的，包括核膜破裂、DNA断裂和酸化。虽然NC核破裂已得到很好的表征，但尚不清楚的是NC质膜是如何被消除的。有可能在酸化之前，NC质膜经历 trogocytosis 或细胞“啃食”，由邻近的FCs进行。这可能为小得多的FCs启动NCs的破坏提供一种有效的机制。

非凋亡性和吞噬性生殖细胞清除机制的保守性很有趣，但也存在一些明显的差异，进一步探索相似性和差异性是未来研究的一个激动人心的方向。在果蝇精巢中，单个囊泡细胞吞噬整个生殖细胞簇，而在果蝇卵巢中，几个SFCs包围每个单独的NC。在胎儿小鼠卵巢中，单个NCs被前颗粒细胞包围，并且NCs被异步酸化，类似于果蝇卵巢中的NCs。在果蝇精巢中，Rab5和Rab7阳性的吞噬体在酸化之前包围活生殖细胞，表明吞噬是吞噬性死亡的潜在机制，而在卵巢中，该过程类似于胞外酸化。然而，在果蝇卵巢的SFCs中也存在酸性囊泡，透射电子显微镜揭示了与SFC膜相邻的囊泡。然而，这些是吞噬（或 trogocytosis）囊泡摄取NC物质，还是释放其内容物到NCs中的囊泡，仍有待确定。活体成像对于解决这些问题至关重要。

囊泡细胞和伸展滤泡细胞向吞噬命运的转变引起了高度兴趣，最近的几项研究已经确定了许多基因供进一步研究。使用高通量筛选技术，发现Toll先天免疫信号通路的多个组分影响NC清除以及卵子发生中后期卵室的完整性和存活。Toll的上游调节因子如SPE、PGRP-LC和PGRP-SD，以及免疫激活的下游产物，如抗菌肽Drs，在SFCs中上调。Toll通路的组分是发挥免疫原性作用还是形态发生作用，或同时实现两者，是一个有待探索的激动人心的研究方向。单细胞技术将为吞噬性细胞中的基因表达变化提供进一步的见解。

非凋亡性和非细胞自主控制的生殖细胞死亡在不同生物体以及精巢和卵巢中都被发现，这一点很引人注目。这表明利用这种形式的细胞死亡在整个进化过程中具有优势。细胞非自主性死亡相对于自主性死亡的两个关键优势是：第一，能够响应外部线索（如年龄或营养可用性）调节死亡率；第二，有可能更好地保存基本细胞单元以供回收利用。鉴于丰富的遗传工具和组织可及性，果蝇和小鼠的卵巢和精巢是进一步研究这些机制的宝贵模型，观察生殖系细胞死亡机制在不同生物体中是如何进化的将是令人兴奋的。