构建并评估一种结合NAA/STZ诱导的2型糖尿病与SD大鼠颈动脉球囊损伤的联合模型

《Frontiers in Endocrinology》：Construction and evaluation of a combined model of NAA/STZ-induced type 2 diabetes with carotid balloon injury in SD rats

本研究构建了NAA/STZ诱导2型糖尿病与颈动脉球囊损伤（VBI）的联合大鼠模型，评估其代谢及血管病理学特征。结果显示，联合模型在2-4周后呈现稳定高血糖、显著加速的血管内增生（neointimal area增加42.6%）、更严重的炎症反应（F4/80阳性率提升33.5%，MMP-9阳性率增加29.2%）及斑块稳定性下降。该模型成功率达90%，术后死亡率14.3%，且未引发其他器官显著病变，为糖尿病血管并发症研究提供了高效可靠工具。

　　糖尿病是一种全球范围内的慢性代谢性疾病，其主要特征之一是血管病变，尤其是大血管的动脉粥样硬化。这种病变在2型糖尿病（T2DM）患者中尤为常见，不仅增加了心血管疾病的风险，还显著提高了残疾和死亡率。因此，建立能够准确模拟T2DM相关血管病变的动物模型，对于深入理解其发病机制和评估潜在治疗手段至关重要。然而，现有的动物模型存在一定的局限性，如复杂的基因操作、漫长的诱导周期等，这些因素在一定程度上阻碍了模型的广泛应用。本文提出了一种结合尼可酰胺（NAA）和链脲佐菌素（STZ）诱导T2DM与颈动脉球囊损伤的联合模型，旨在解决上述问题，并提供一个更贴近临床情况的研究平台。

### 研究背景与意义

在T2DM患者中，大血管病变主要表现为动脉粥样硬化，通常影响中等大小的动脉，如冠状动脉、脑基底动脉、颈动脉、肾动脉和下肢动脉。长期的高血糖状态会导致氧化应激和内皮功能障碍，这些变化会促进粘附分子和趋化因子的表达，进而引发巨噬细胞的大量浸润和血管平滑肌细胞的迁移与增殖。高血糖还会诱导氧化低密度脂蛋白的生成，导致泡沫细胞的形成，同时抑制胶原蛋白的合成，这些因素共同增加了动脉粥样硬化斑块破裂的风险。此外，高血糖还会激活血小板，降低内源性血小板抑制因子的水平，从而促进血栓形成。因此，T2DM被认为是动脉粥样硬化疾病的显著风险因素，而斑块破裂引发的心血管事件在糖尿病患者中更为频繁，这主要归因于广泛的血管参与和弥漫性的动脉粥样硬化病变。

为了更好地研究T2DM相关的血管病变，需要一种能够再现其病理特征的动物模型。尽管小鼠在生物和临床前研究中被广泛使用，但它们缺乏胆固醇酯转移蛋白（CETP），这导致了与人类不同的脂蛋白分布模式，从而降低了其发生动脉粥样硬化的可能性。因此，构建小鼠模型通常需要基因改造，例如与糖尿病相关基因缺陷的小鼠进行杂交，这限制了模型的大规模应用。相比之下，大鼠在构建T2DM模型方面具有明显优势，如高脂肪饮食结合STZ诱导的模型虽然被广泛应用，但其诱导周期较长、饲料成本较高、口感不佳，且未能充分再现动脉粥样硬化病变。

近年来，随着经皮血管介入治疗的广泛应用，临床观察发现动脉粥样硬化斑块不仅可以在自然状态下形成，也可以在血管内膜剥脱、球囊扩张和支架植入等操作后发生。动物实验进一步证实，球囊扩张和旋转可以完全剥脱血管内皮层，并且在损伤部位形成时间依赖性的新生内膜增生，这加速了动脉粥样硬化的自发进展。因此，颈动脉球囊损伤模型被开发出来，大鼠因其血管大小和操作便利性成为首选动物模型。该模型具有高可重复性、可控的损伤程度和长度、操作简便、术后死亡率低以及建模周期短等优点，广泛应用于动脉粥样硬化研究。

### 模型构建方法

为了构建一个既能模拟T2DM又具备动脉损伤特征的模型，研究团队采用了NAA/STZ联合诱导法。NAA和STZ的联合使用最早由Masiello P等人在1998年提出，用于构建非肥胖型T2DM的大鼠模型。NAA具有一定的细胞保护作用，可以部分抵消STZ对胰岛β细胞的毒性作用，从而保留一定的胰岛素分泌能力。这种方法能够在不依赖外源性胰岛素的情况下维持稳定的中度高血糖状态，同时保留部分葡萄糖刺激下的胰岛素分泌功能，使其更接近人类T2DM的病理特征。

实验中使用了60只雄性Sprague–Dawley（SD）大鼠，分为四个组：对照组、单纯血管球囊损伤组（VBI）、单纯T2DM组和联合模型组（T2DM+VBI）。在T2DM组中，大鼠首先接受NAA（110 mg/kg）的腹腔注射，随后15分钟后再接受STZ（65 mg/kg）的注射。在VBI组中，大鼠接受了颈动脉球囊损伤操作，使用的是经皮穿刺冠状动脉成形术（PTCA）球囊导管。为了评估模型的成功率和稳定性，研究团队在建模后第3天和第7天测量随机血糖（RBG），当RBG≥16.7 mmol/L时，认为T2DM模型成功建立。

### 实验结果与分析

实验结果显示，T2DM模型的成功率高达90%，且建模过程中没有死亡发生。而联合模型组（T2DM+VBI）在建模后第6周的术后死亡率为14.3%，明显高于单纯VBI组的7%。这可能与糖尿病状态下较高的血小板聚集和血栓形成风险有关，这些风险是由氧化应激和促炎介质的激活所驱动的。

在代谢指标方面，对照组和VBI组的饮食摄入、饮水量、排泄量和血糖水平均保持稳定，没有显著差异。而T2DM组和T2DM+VBI组则表现出显著的代谢异常，包括饮食摄入和饮水量的增加，以及排泄量的上升。T2DM组的血糖水平始终高于对照组，且维持在较高的水平，而T2DM+VBI组在建模后一周内血糖水平有所下降，但随后逐渐回升，始终高于对照组。这些结果表明，T2DM组和T2DM+VBI组均表现出典型的糖尿病症状，如多饮、多食和多尿，同时维持稳定的高血糖状态。

在血管组织学分析方面，对照组和T2DM组的颈动脉组织未观察到明显的内膜增生，而VBI组和T2DM+VBI组在建模后2周开始出现内膜增生。T2DM+VBI组的内膜增生面积明显大于VBI组，且在建模后6周时，内膜增生程度接近于完全阻塞血管腔。此外，T2DM+VBI组的内膜增生指数和狭窄百分比均显著高于VBI组，说明糖尿病环境显著加速了内膜增生的发展。值得注意的是，在建模后2周，T2DM+VBI组的内膜增生情况与VBI组在建模后6周时相似，这表明糖尿病环境可以缩短建模时间，2至4周可能是观察内膜增生的最佳时间窗口。

在免疫组织化学分析中，研究团队对内膜区域的α-SMA（血管平滑肌细胞标志物）和F4/80（巨噬细胞标志物）进行了染色。结果显示，无论是T2DM组还是T2DM+VBI组，内膜增生的主要细胞成分均为巨噬细胞和血管平滑肌细胞，但糖尿病环境下这些细胞的增殖和浸润更为显著。此外，T2DM+VBI组的MMP-9（基质金属蛋白酶-9，与斑块破裂和重塑相关）染色阳性面积明显大于VBI组，表明在糖尿病状态下，内膜增生更容易发生炎症损伤，且斑块稳定性较差。

### 重大器官的组织学评估

在建模后6周，研究团队对大鼠的主要器官进行了组织学分析。结果显示，所有实验组的肝脏、心脏、肺部、脾脏和肾脏组织均未出现显著的组织结构异常，除T2DM组外。T2DM组的肝脏组织表现出明显的脂肪变性和细胞肿胀，而T2DM+VBI组的肝脏损伤相对较轻，仅观察到少量的水肿和散在的脂肪变性细胞。这些结果表明，该联合模型并未引发严重的器官功能障碍，如明显的肝肾功能异常或严重的脂代谢紊乱，这对于模拟T2DM早期并发症非常重要。同时，这些数据也表明，模型在一定程度上避免了因严重器官损伤而引入的干扰因素，从而更真实地再现了T2DM相关的血管病变。

在血液细胞计数和血浆生化指标方面，各组之间的差异不显著。尽管T2DM组和T2DM+VBI组的红细胞和白细胞计数有所下降，但这些变化未达到统计学意义。此外，血红蛋白和血小板水平在各组之间也没有显著差异。这些结果进一步支持了该模型的可靠性，表明其不会对全身其他器官造成显著的病理影响，从而为研究血管病变提供了更为清晰的背景。

### 模型的优势与应用前景

本研究构建的NAA/STZ诱导T2DM联合颈动脉球囊损伤模型，具有多项优势。首先，该模型能够稳定地维持高血糖状态，且建模周期较短，仅需6周即可观察到显著的内膜增生。其次，模型的成功率较高，达到90%，且在建模过程中未出现死亡，这在一定程度上降低了实验的复杂性和成本。此外，该模型能够准确模拟T2DM相关的血管病变，包括内膜增生、炎症反应增强以及斑块稳定性降低等特征，使其成为研究糖尿病相关血管病变的理想工具。

该模型的建立为后续研究提供了重要的基础，特别是在评估潜在药物的疗效和相关分子机制方面。通过比较单纯糖尿病模型和单纯血管损伤模型，研究团队发现，糖尿病环境显著促进了内膜增生的进展，且其影响在建模后2至4周达到高峰。这表明，该模型不仅能够再现糖尿病相关的血管病变，还能够缩短建模时间，提高研究效率。同时，该模型避免了因严重器官损伤而引入的干扰因素，使得研究结果更加贴近人类T2DM的病理特征。

### 未来研究方向

尽管本研究构建的模型已经显示出良好的应用前景，但仍存在一些局限性。例如，在免疫组织化学分析中，研究团队未能同时检测CD68和F4/80两种标志物，而CD68作为人类组织中巨噬细胞的特异性标志物，可能更适用于跨物种比较。此外，虽然当前的实验结果表明该模型在早期T2DM相关并发症的再现方面具有优势，但进一步整合功能评估（如肾小球滤过率）和组织学分析（如PAS染色和油红O染色）将有助于更全面地模拟T2DM的病理特征。

总的来说，该联合模型为研究糖尿病相关的血管病变提供了一个可靠、高效且经济的平台，其稳定的高血糖状态、明显的内膜增生以及较低的术后死亡率，使其成为未来糖尿病相关血管疾病研究的重要工具。通过进一步优化实验设计和补充相关分析方法，该模型有望在更多领域发挥其潜力，为开发新的治疗策略提供坚实的实验基础。