利用CRISPR表观基因组编辑技术挽救普拉德-威利综合征细胞模型中印记基因的表达

《Nature Communications》：Rescue of imprinted genes by epigenome editing in human cellular models of Prader-Willi syndrome

本研究针对普拉德-威利综合征(PWS)的治疗难题，开发了基于CRISPR/dCas9-Suntag-TET1系统的表观基因组编辑策略，成功在患者来源iPSCs中靶向PWS印记控制区(PWS-ICR)实现DNA去甲基化，恢复了母源等位基因上印记基因(SNRPN、SNORD116、MAGEL2等)的表达。该表观遗传修饰在下丘脑类器官分化过程中保持稳定，并部分逆转了PWS相关的转录组紊乱，为印记疾病治疗提供了新思路。

　　

在遗传学领域，普拉德-威利综合征（Prader-Willi syndrome, PWS）是一种罕见的基因组印记疾病，由于父源染色体15q11-13区域的基因功能缺失导致。患者表现出食欲亢进、性腺功能减退和生长激素缺乏等一系列与下丘脑功能障碍相关的症状。尽管已知该区域多个父源表达基因（paternally expressed genes, PEGs）的沉默是致病关键，但针对性的治疗方法至今匮乏。更棘手的是，传统的表观遗传调控药物存在基因组范围效应，缺乏位点特异性，难以精准治疗。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，日本庆应义塾大学的研究团队另辟蹊径，利用CRISPR表观基因组编辑技术，在PWS患者来源的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）模型中成功激活了母源染色体上沉默的印记基因，为疾病治疗提供了新的可能。

研究人员采用CRISPR/dCas9-Suntag-TET1表观基因组编辑系统，精准靶向PWS印记控制区（PWS imprinting control region, PWS-ICR）。该系统通过向导RNA（guide RNAs, gRNAs）引导缺乏切割活性的dCas9蛋白与TET1去甲基化酶融合蛋白至目标区域，实现特异性DNA去甲基化。实验使用包括缺失型、母源单亲二体（maternal uniparental disomy, mUPD）和印记缺陷型在内的多种PWS患者来源iPSCs，通过慢病毒递送gRNAs和脂质体转染dCas9-Suntag-TET1组分。通过甲基化敏感性内切酶-qPCR、靶向亚硫酸氢盐测序和纳米孔长读长测序等多技术验证编辑效果，并利用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）和钙成像等功能分析评估转录组和神经元活动的恢复情况。

恢复SNRPN基因表达通过CRISPR介导的表观基因组编辑

研究人员首先在PWS患者来源iPSCs中靶向PWS-ICR进行编辑。结果显示，编辑后的细胞克隆中SNRPN基因表达水平恢复至与健康对照相当，且表达稳定性在多次传代后仍得以维持。基因测序和短串联重复分析证实该恢复非基因突变或细胞污染所致。

PWS-ICR的去甲基化及表观基因组编辑的脱靶效应

DNA甲基化分析表明，编辑后的iPSCs中PWS-ICR区域甲基化水平显著降低（缺失型降至0%，mUPD型降至50%）。通过生物信息学工具预测的潜在脱靶位点均未检测到甲基化改变或邻近基因表达异常，证明该编辑策略具有高度特异性。

通过PWS-ICR表观基因组编辑挽救其他PWS相关印记区域的表达和表观基因组重组

研究进一步发现，PWS-ICR的去甲基化可激活SNORD116、IPW和MAGEL2等其他PWS相关基因的表达。纳米孔测序显示MAGEL2启动子区发生去甲基化，而NDN基因则未受影响，表明编辑效果具有基因特异性。

印记基因重组的动力学

时间进程实验显示，MAGEL2的去甲基化和表达上调滞后于PWS-ICR编辑，表明其可能由PWS-ICR去甲基化触发的次级表观遗传重组所致，而非编辑系统的直接脱靶效应。

PEG表达和DNA甲基化状态在下丘脑类器官分化过程中的变化

由于PWS症状与下丘脑功能密切相关，研究人员将编辑后的iPSCs分化为下丘脑类器官。结果显示，PEGs表达激活和印记区域去甲基化状态在分化后得以维持，类器官表现出正常的下丘脑特征。

表观基因组编辑的下丘脑类器官中神经元特异性印记基因表达的激活

在iPSCs阶段不表达的神经元特异性基因SNORD115和UBE3A-ATS在类器官分化后成功激活。UBE3A-ATS的上调伴随UBE3A表达下降，符合其反义转录本的生物学功能。MKRN3基因的表达和甲基化模式也得到部分恢复。

表观基因组编辑类器官基因表达变化的表征

单细胞转录组分析显示，编辑后的类器官神经元集群中突触功能相关基因富集，而核糖体生物发生相关基因下调，这与PWS患者下丘脑转录组特征相反。RRHO2分析进一步证实编辑部分逆转了PWS相关的转录组紊乱。

表观基因组编辑类器官的神经元活动

钙成像实验表明，PWS类器官自发性神经元活动降低，而编辑后的类器官活动恢复至正常水平，证明表观基因组编辑可改善神经元功能。

PWS类器官中的表观基因组编辑

研究还尝试在分化阶段的类器官中直接进行编辑，虽可部分激活SNRPN表达，但效果未达到健康对照水平，提示早期干预的重要性。

本研究通过CRISPR表观基因组编辑技术，在PWS疾病模型中实现了持久的印记基因激活和表观遗传重塑。不仅证实了PWS-ICR在调控邻近印记区域中的核心地位，还展示了该策略部分逆转疾病相关转录组和功能异常的能力。尽管在NDN等基因的激活方面存在局限，且对于mUPD患者需解决单等位基因编辑特异性问题，但研究为PWS及其他印记疾病的治疗提供了概念验证。结合递送系统的优化和长期安全性评估，表观基因组编辑有望成为精准医疗的新武器。