《Veterinary Parasitology》：Bovine macrophages transcriptome profiling reveals divergent responses to virulent and attenuated
Babesia bovis strains
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巴贝斯虫单核细胞衍生巨噬细胞吞噬红细胞后转录组分析揭示毒株与减毒株诱导的差异免疫应答，共同核心响应涉及淋巴细胞功能、细胞因子调节和适应性免疫信号通路，而毒株主要激活淋巴细胞和抗病毒相关通路，减毒株则增强炎症反应、趋化作用及细胞外基质重塑特征。
瓦伦扎诺·马加利·妮可（Valenzano Magalí Nicole）、莉莉安娜·阿尔瓦雷斯（Liliana Alvarez）、贝阿特丽斯·瓦伦蒂尼（Beatriz Valentini）和西尔维娜·威尔科夫斯基（Silvina Wilkowsky）
阿根廷布宜诺斯艾利斯Hurlingham B1686IGC，Los Reseros和Nicolás Repetto街，国家农业技术研究所（INTA）下属的农业生物技术和分子生物学研究所（IABIMO），国家科学技术研究委员会（CONICET）
摘要
牛巴贝斯虫（Babesia bovis）是一种通过蜱虫传播的寄生虫，对畜牧业具有重大经济影响。控制策略主要依赖于杀螨剂和减毒活疫苗的使用。比较基因组分析显示，毒力强和减毒的B. bovis菌株之间没有显著差异，这表明研究宿主的差异反应可能是阐明疾病严重程度和疫苗效果的关键步骤。在这项研究中，我们通过RNA-seq分析了牛单核细胞衍生的巨噬细胞在吞噬感染了毒力强的S2P菌株或减毒的R1A菌株的红细胞后的差异基因表达。结果揭示了几种细胞过程的共同转录反应，主要集中在淋巴细胞相关功能、细胞因子调节和适应性免疫信号传导方面。然而，这两种菌株在牛巨噬细胞中引发了不同的反应：毒力强的菌株促进了与淋巴细胞和抗病毒相关的通路富集，而减毒菌株则导致了更强的促炎反应、趋化作用和细胞外基质重塑。总体而言，这些数据增强了我们对巨噬细胞在吞噬含有不同B. bovis菌株的红细胞后发生的早期转录事件的理解。这一大型数据集可以在进一步的研究中用于更好地表征牛巴贝斯虫病的致病机制，并确定针对宿主的治疗策略目标。
引言
牛巴贝斯虫病主要由Babesia bovis和Babesia bigemina引起，是一种通过蜱虫传播的疾病，在热带和亚热带地区具有重要的兽医和经济意义，尤其是在Rhipicephalus蜱虫流行的地区（Jacob等人，2020年）。在这些原生动物寄生虫中，它们仅在牛的红细胞内侵入和繁殖。特别是在成年牛中，这会导致严重的临床症状，包括高烧、溶血性贫血和血红蛋白尿。在导致牛巴贝斯虫病的两个主要物种中，Babesia bovis感染由于能够附着在毛细血管上并阻塞血液循环，可能导致高死亡率（Bock等人，2004年；Brown等人，2006年）。
对Babesia bovis的免疫反应包括先天性和适应性机制。先天性免疫反应涉及巨噬细胞和树突状细胞的早期激活，从而产生促炎细胞因子。适应性反应主要由调理抗体和Th1型细胞免疫反应介导，其特征是分泌干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子（TNF-α）。这些细胞因子通过增强脾脏巨噬细胞的活性来清除受感染的红细胞，并支持IgG2的产生（Brown等人，2006年）。
目前针对Babesia bovis的疫苗基于在脾切除的小牛体内连续传代或体外培养得到的减毒活寄生虫，在许多国家已成功使用（de Waal & Combrink，2006年）。接种这些菌株可诱导强大且持久的免疫力，其保护效果与自然感染相似，但不会出现严重的临床症状（Ristic，2018年）。据推测，减毒作用是由于选择了在循环系统中存活的毒性较低的亚群，而毒性更强的寄生虫则被滞留在微血管中并在连续传代过程中丢失（Baravalle等人，2012年）。先前的一项研究比较了毒力强和减毒Babesia bovis菌株的脂质组成，发现磷脂谱的差异调节了宿主免疫反应的强度和性质（Gimenez等人，2013年）。这些发现表明，宿主-寄生虫相互作用背后的信号机制可能是决定疾病结果和免疫激活的重要因素。因此，从分子水平上理解宿主对毒力强和减毒菌株的差异反应对于阐明疾病严重程度和疫苗效果至关重要。
RNA测序（RNA-seq）的最新进展使得能够全面表征宿主对原生动物感染的转录反应（Menard等人，2021年；Terkawi等人，2018年）。此外，转录组分析已成功应用于研究Babesia bigemina感染期间外周血单核细胞的差异基因表达，揭示了免疫激活和炎症的重要机制（Martínez-García等人，2025年）。然而，迄今为止，还没有研究在Babesia bovis诱导的免疫反应背景下对牛巨噬细胞的完整转录组进行表征，也没有比较毒力强和减毒菌株引起的反应。
在这项工作中，我们分析了感染了毒力强和减毒Babesia bovis菌株的牛单核细胞衍生的巨噬细胞的宿主转录反应。通过比较每种菌株诱导的基因表达谱，我们旨在更好地理解它们在宿主体内引发的免疫反应，并探索减毒寄生虫如何在不引发严重病理的情况下引发保护性免疫。
实验部分
Babesia bovis培养
根据Baravalle等人（2012年）的方法，使用微需氧静态培养系统，在含有健康供体正常牛红细胞的条件下，对阿根廷的毒力强S2P菌株和减毒R1A菌株进行了体外培养。当寄生虫载量达到10%时使用这些寄生虫。牛单核细胞衍生的巨噬细胞（BMDM）和吞噬实验
BMDM的获取方法如Valenzano等人（2025年）所述。根据Blanco等人（2021年）的研究，该方案可产生约93%的CD14阳性巨噬细胞。测序
为了研究牛巨噬细胞在暴露于感染了Babesia bovis S2P和R1A菌株的红细胞以及未感染的红细胞时的转录反应，我们从三个实验组生成了双端测序文库。为便于区分，这些条件分别称为S2P、R1A和nRBC。每个样本获得了16151764至35361940条读段（表1）。质量评估表明数据质量一致较高。
讨论
RNA测序已成为研究宿主-病原体相互作用的强大工具，因为它能够识别感染期间被调节的特定通路和分子机制，而这些机制通过传统方法难以发现。这种策略已广泛用于研究其他原生动物寄生虫引起的感染，包括恶性疟原虫（Plasmodium falciparum，Terkawi等人，2018年）和弓形虫（Toxoplasma gondii，Menard等人，2021年）。
结论
在本文中，我们通过RNA-seq研究了吞噬了毒力强或减毒Babesia bovis菌株的红细胞的单核细胞衍生的巨噬细胞的转录反应。除了共同引发的转录反应（即多种免疫细胞过程的上调或下调外，不同菌株还在牛巨噬细胞中引发了显著不同的反应，其中一些功能通路被激活或失活。
资金支持
本研究得到了英国国际兽医疫苗学网络（International Veterinary Vaccinology Network）2018年的资助。
作者贡献声明
西尔维娜·威尔科夫斯基（Silvina Wilkowsky）：撰写、审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思。贝阿特丽斯·瓦伦蒂尼（Beatriz Valentini）：资源提供。莉莉安娜·阿尔瓦雷斯（Liliana Alvarez）：数据分析。瓦伦扎诺·马加利·妮可（Valenzano Magali Nicole）：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、实验设计、数据分析、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢Pablo Vera先生在IABIMO基因组设施中协助准备测序文库，以及Julio Di Rienzo博士在统计分析方面提供的有益建议。同时，也感谢Diego Franco和Verónica Maldonado在动物处理方面的帮助。
